肌红蛋白为单肽链蛋白质含153个氨基酸残基.ppt

（二）肽的的圆二色性 Secondary structure of macromolecule α-helix:190nm (+) 208nm, 222nm (-) β-sheet:195nm (+),antiparallel: red shiftparallel: blue shift215-217nm(-) Unordered structure: (-) below 200nm (+) 218nm weak bandunordered β-turn: 180-190nm (-) 200-205nm (+),225nm (+), band, weak red shift 4.4 三级结构测定 X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。 氨基酸的定性和定量分析一般采用纸层析、薄层层析、离子交换柱层析等方法。采用HPLC仪和氨基酸自动分析仪更好。随着仪器的不断改进，一个样品的测定仅需20min即可完成。 、氨基酸定性和定量分析 单向纸层析 双向纸层析 薄层层析 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC） 蛋白质中氨基酸的组成一般用每摩尔蛋白质中氨基酸残基的摩尔数表示，或每100g蛋白质中含氨基酸的克数表示。 所以只有知道蛋白质的相对分子质量，才能推出它的氨基酸组成。 例：血小板衍生生长因子的氨基酸组成 本实验室的分析结果 4.2 蛋白质的末端测定 一、N-末端的测定 二、C-末端的测定 三、封闭N-末端的测定 末端分析通常采用专一性化学试剂与末端氨基或羧基反应，然后分解出被作用的末端氨基酸加以测定。由于与羧基反应的活化能相当高，所以用于与羧基反应的专一性试剂比较少，而N端测定的方法较多。氨肽酶及羧肽酶等外切酶也常有应用。 一、N-末端的测定 N末端测定方法比C末端更加成熟、可靠和 准确，主要的方法有： 1、二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法） 2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法） 3、异硫氰酸苯酯法（PITC法） 4、DABITC法 5、氨肽酶法 1、二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法） 二硝基氟苯在弱碱性条件下，与肽链的N端氨基作用，形成二硝基苯基肽链（DNP-肽），经 酸水解后，N端残基成为二硝基苯基（DNP）-氨 基酸，可用有机溶剂（如乙醚）抽提，再进行纸 层析或薄层层析后，根据层析斑点的位置作定性 鉴定。 FDNB不仅与N-末端的α-氨基起反应，也与侧链上的ε-氨基、巯基、酚羟基和咪唑基反应，但水解产物极性较强，不被乙醚抽提，而不干扰末端的测定。 当N-端残基为脯氨酸或羟脯氨酸时，因DNP-脯氨酸或DNP-羟脯氨酸在盐酸水解条件下极不稳定，如DNP-脯氨酸易分解成脯氨酸以及δ-氯-α-DNP-氨基戊酸和α-氯-δ-DNP氨基戊酸，所以回收率甚低，不能进行测定。 2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法） 荧光剂DNS-Cl可与肽链N端氨基反应生成 DNS-肽，经酸水解，N-末端残基形成DNS-氨 基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用层析法鉴定。 DNS-氨基酸于360nm或280nm处产生强烈荧 光，根据荧光点位置确定N端氨基酸。 DNS-脯氨酸经6 M HCl于110℃水解过夜有70%被破坏。 色氨酸及其DNS衍生物在盐酸水解时完全被破坏，可改用巯基乙烷磺酸在真空下水解，并用乙酸乙酯抽提非极性得DNS-氨基酸加以鉴定。 赖氨酸的ε-氨基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基以及酪氨酸的羟基也能与DNS-Cl进行反应。但半胱氨酸和组氨酸侧链衍生物在酸水解时并不稳定。 当N-末端为组氨酸、精氨酸或半胱氨酸（S-羧甲基半胱氨酸形式或磺酸形式）时，对其测定也受到一定限制。 当N-末端氨基酸为谷氨酸或谷氨酰胺、天冬氨酸或天冬酰胺时，因有高温水解过程，对它们不能区别。 3、异硫氰酸苯酯法 在弱碱中，异硫氰酸苯酯（PITC）与N端氨基偶联生成苯基硫甲酰衍生物（PTC-肽）。在酸性溶液中，PTC-肽经环化裂解生成PTC-氨基酸和N端少个氨基酸的剩余多肽。由于PTC-氨基酸不稳定，很快转化成苯基乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）。 生成PTH-氨基酸非常稳定，在268nm处有强吸收峰。 噻咪啉酮衍生物经氯乙烯抽提后，留下的