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原位杂交技术 2012.11.22 目录 背景 基本原理 试验流程 分类 应用领域及优点 临床应用局限性 改进措施 前景 * 2012.11.22 背景 原位杂交( In Situ Hybridization, ISH )技术始于20世纪60年代。 1969年首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位。 1970年利用同位素标记核酸探针进行了基因定位，从而产生了原位杂交技术。 * 2012.11.22 基本原理 利用碱基互补配对原则，将有标记的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸的位置显示出来。 * 2012.11.22 原位杂交的三个重要条件 组织、细胞或染色体的固定 具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针) 有与探针结合的标记物 * 2012.11.22 标本制备 固定 固定剂 ：4%多聚甲醛 固定方法：浸润法，灌注法 切片 冰冻切片 石蜡切片 * 2012.11.22 核酸分子探针 核酸探针是指带有标记物的已知碱基序列的核酸片段，能与靶核酸即待测核酸反应，是用于组织细胞内的特定核酸序列定位的关键试剂。 * 2012.11.22 探针的种类 基因组DNA探针 cDNA探针 cRNA探针 寡核苷酸探针 * 2012.11.22 探针的标记 放射性同位素 ：3H 、35S、32P 非放射性标记物 ： 生物素、地高辛、罗丹明 * 2012.11.22 杂交反应 双链DNA探针和靶DNA变性 杂交温度和时间 30~60℃之间孵育过夜 * 2012.11.22 杂交后处理 杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度盐溶液的漂洗，盐浓度由高到低，而温度由低到高，漂洗10～15min。 * 2012.11.22 杂交体检测 放射性同位素标记探针的检测 ：放射自显影 * 2012.11.22 杂交体检测 非放射性标记探针的检测：免疫酶组织化学或亲合组织化学技术显示。 * 2012.11.22 荧光原位杂交技术 利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切片上的特异核酸进行杂交，通过荧光检测系统检测DNA在染色体或DNA显微切片上位置。 FISH技术的原理图解 * 2012.11.22 多色荧光原位杂交技术 利用几种不同颜色的荧光素标记的探针进行原位杂交，能同时检测多个靶位，克服了FISH技术的局限，能同时检测多个基因。 * 2012.11.22 原位PCR 通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。 * 2012.11.22 优点 ①特异性强、灵敏度高，同时又有组织细胞化学染色的可见性。 ②既可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究。 ③所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞涂片。 ④应用范围广泛，可对特定的基因(如癌基因、病毒基因)DNA、mRNA的表达进行定位、定性和定量、组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞定位研究。 * 2012.11.22 应用领域 ①细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因 图谱，基因表达和基因组进化的研究； ②感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位； ③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水 平的表达及其变化的检测； ④基因在染色体上的定位； ⑤检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色体易位 等； ⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某 些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学 剂量测定等。 * 2012.11.22 临床应用局限性 提高检测单拷贝基因的敏感性，用非放射性物质代替放射性同位素标记探针以及简化实验操作和缩短杂交时间。 * 2012.11.22 改进措施 完善非放射性标记探针； 靶序列和探针的扩增以及信号的放大； 发展简单的杂交方式。 * 2012.11.22 前景 原位杂交技术因具高度的灵敏性和准确性而广泛应用于基因定位、病毒检测、转基因的检测、遗传育种、性别鉴定和基因图谱的构建等研究领域。 * 2012.11.22 Thank you !!! *