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* 按照下列条件进行PCR反应。 94 ℃ 2 min 94 ℃ 30 sec 30循环 50 ℃ 30 sec 72 ℃ 90 sec 72 ℃ 7 min 4 ℃ ∞ * RT-PCR产率低的主要原因 （1）反转录cDNA的合成效率低，更多情况下是因为cDNA　扩增效率低。可以使用一系列不同浓度的cDNA模板进行扩增，模板量非最适时产生许多弥散的扩增产物。 （2）确定了最佳cDNA模板浓度后，可以通过改变Mg2+浓度或Tm值，进一步进行反应体系的优化。 （3）必要时纯化cDNA第一链。 （4）有必要建立对照反应，以检测cDNA的合成效率。 * 实验二 特异扩增片段的回收、连接、转化及质粒DNA提取 * 对于PCR反应得到的多条条带，可以利用凝胶回收的方法得到需要的特异条带。也可以利用纯化试剂盒纯化具有单一条带的PCR产物。 在高盐状态下，树脂专一性地吸附DNA ，去除多余的小片段和离子后，在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。纯化后的PCR产物便于和载体连接。 * 利用小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收特异片段或纯化PCR产物 采用特殊硅基质材料在一定高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA，在低盐缓冲液或水中洗脱下来，同时去除各种蛋白质、无机盐和许多有机物等杂质，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，分离片段。 其机理可能为：高浓度的盐离子破坏硅基质水分子结构，形成阳离子桥，当盐被清除后，再水化的硅质破坏了基质和DNA之间的吸引力，因此DNA从硅基质上洗脱下来。 * 操作程序 在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶，得到胶的体积越小越好。 DNA溶液(50－100μl)或者含有DNA的凝胶 　　　　加入300u1溶胶液DD 56度放置10分钟（至胶完全溶解），每２－３分钟涡旋震荡一次加速溶解。 将溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），室温放置1分钟，12000 rpm，离心30－60秒；去掉收集管中的废液。 加入700 μl漂洗液WB漂洗，12000 rpm离心30秒。倒掉废液。 加入500 μl漂洗液漂洗一次， 12000 rpm离心30秒,倒掉废液。 将吸附柱AC放回空收集管中，12000 rpm离心2 min。（空离，甩干残余液体，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应） 室温放置至无乙醇残留，否则会影响后续酶促反应。 取出吸附柱AC,放入一干净的离心管中，向柱子中间部位加入30 μl的洗脱缓冲液EB（Elution buffer），（要加在柱子中央，室温放置1－2分钟）12000 rpm离心洗脱。 * 把扩增后的PCR溶液加到硅基质膜上时，目的片段就会特异的结合上去，而其它如dNTP、引物二聚体、非特异性或小于100 bp的片段等杂质会被过滤掉，通过后面的漂洗步骤可进一步去掉多余的杂质，最后用水或者洗脱缓冲液就可以把目的片段洗脱下来。 如果要回收溶液中多种DNA片段中的一种，采用切胶纯化是最有效的方法。通过琼脂糖凝胶电泳分开特异性和非特异性条带，在紫外光照射下，快速、有效的切下目的片段所在位置的凝胶，纯化得到目的片段。 * 实验二 特异扩增片段的回收、连接、转化及质粒DNA提取 * 要利用或克隆特异的DNA片段，必须将其连接到特异的载体中，然后进行转化，才能够长期保存。 大肠杆菌在特殊试剂的处理下，可以处于感受态，易于接受外源DNA。经过热激和冷冻可以增加大肠杆菌细胞膜的通透性，便于重组质粒DNA进入大肠杆菌。可以利用蓝白斑进行筛选，白斑是含有重组质粒的大肠杆菌菌落。 通过此实验学习转化的基本实验步骤和实验原理，知道通过转化可以鉴定连接的效率。 * 1.　回收产物与载体的连接 利用聚合酶扩增的产物两端序列的3’端都具有腺苷酸的特点，而T-载体在线性3’末端都含有胸腺嘧啶核苷酸，将PCR产物可以直接连接到T-载体中。 * 克隆基因片断 -A A - T-载体 T - -T 重组载体 16℃连接16h 实验流程 * 质粒载体上的lacZ位点与Amp位点 * 实验步骤 1、利用T-载体试剂盒进行连接反应。 H2O 5μl 10×Buffer 1μl DNA 2 μl 载体