多顺反子真核表达载体的构建与亚细胞定位鉴定.doc

多基因真核表达载体的构建与亚细胞定位研究 靳志平1, 2 谭晓华1,3 [摘要]　目的 构建一种多基因表达载体，实现同一载体单一启动子的调控下表达多个基因以及这些基因在同一细胞不同细胞器中的定位。方法 利用存在于某些病毒核酸序列中的不同2A肽，合成一段包括2个2A肽和不同限制性内切酶位点的多肽序列，形成单一的开放读码框，插入真核表达载体pcDNA3.1(-) Myc/His(B)相应的多克隆位点中，然后将带有膜定位的红色荧光蛋白（ERFP）、核定位的绿色荧光蛋白（EGFP）和胞浆定位的黄色荧光蛋白（EYFP）顺序插入2A肽之间的位点中，构建多基因真核表达载体pcDNA3.1 RGY。用脂质体转染小鼠成纤维NIH3T3细胞和人肾胚293细胞，利用流式细胞仪、荧光显微镜和共聚焦显微镜检测各种荧光蛋白的表达和亚细胞定位。结果 转染24小时后用流式细胞仪检测，可同时检测到ERFPEGFP的表达，且种荧光蛋白的表达率十分接近；荧光显微镜下同时观察到荧光；共聚焦显微镜观察到在单一细胞上同时显示三种荧光， ERFP定位在细胞膜上，EGFP在细胞核中，而EYFP在细胞浆中。结论 通过串联方式将多个2A肽和基因置于同一个开放读框中可实现在同一启动子的调控下表达多个基因。此外，在每个基因序列中加入不同的信号肽序列可将相应基因同时靶向不同的细胞器，实现同一细胞中不同的亚细胞定位。[关键词]　 真核表达载体 基因表达　信号肽序列 亚细胞定位　2A肽 基金项目：国家自然科学基金资助项目General Program of National Natural Science Foundation of China 作者：靳志平，男，学士学位，初级职称，肿瘤学，电话Email:158239880@ 作者单位：1. 北京军区总医院中心实验科，北京 100700； 2. 第三军医大学研究生管理大队学员二队，重庆 100027； 3. 天津迪艾细胞与分子医学发展有限公司，天津 300142 通讯作者：谭晓华 Email: xiaohua_t@ Construction of a multi-gene eukaryote expression vector and sub-cellular localization Jin Zhiping, Tan Xiaohua Center of biological treatment, The military general hospital of Beijing PLA Beijing 100700, China [Abstract] Objective To construct a multi-gene eukaryote expression vector in which the coexpression of multiple genes were accomplished and their products were located in different organelles in a single cell under control of the same promoter. Methods A artificial nucleotide sequence including two different ‘2A’ peptide originated from some viral sequences and several restriction sites were synthesized to form a single open reading frame and inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-) Myc/His(B). ERFP with membrane localization signal, EGFP with nuclear localization signal and cytoplasmic EYFP were in order inserted into the sites between the ‘2A’ peptide for constructing the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 RGY. The vector was transfected to NIH3T3 cells or 293 cells by Liposome, and expression levels of the fluorescent proteins and their subcellular