Western Blotting及常见问题分析.pptVIP

信号弱或者无信号 原因： 解决办法 转膜不完全 1.转膜后，确定转膜效率 2.保证转膜时胶与膜充分结合 3.滤纸－膜－胶，电极方向正确装配 4.根据说明书，对膜进行处理如湿润 5.电转时防止过热 6.使用阳性对照或预染Marker 7.优化转移时间和电流 8.保证样品处理时，样品不被破坏（抗原决定簇） 蛋白质与膜结合不充分 加20％甲醇于转膜缓冲液； 低分子蛋白质透过膜；使用小孔径膜 抗体 增加抗体浓度；抗体与抗原结合差；抗体丧失活性 抗原不足 增加上样量 抗原被封闭液遮蔽 试用不同的封闭液 优化封闭液中蛋白质浓度 缩短封闭时间 缓冲液里有叠氮钠 去掉叠氮钠 曝光时间太短 延长曝光时间 底物孵育时间太短 5分钟 膜的选择错误 注意膜的质量 底物丧失活性 避免使用超过有效期的底物试剂 膜被剥离过 剥离会导致抗原丢失或变性 避免重复检测 膜上蛋白质被消化（gelatin) 封闭物质可能有蛋白质降解活性 蛋白质在储存过程中降解 重新制备样品 信号弱或者无信号－续表 非特异性条带 原因： 解决办法： 底物太灵敏 选择合适的底物 交叉反应 选择单克隆抗体 抗原浓度太高 降低抗原浓度 抗体浓度太高 降低抗体浓度 曝光时间太长 减少曝光时间 信号下降太快 原因： 解决办法： 抗体浓度太高 1.降低抗体浓度，特别是二抗浓度 推荐 对照设置 内参照 beta-actin /beta-tubulin/GAPDH 阳性对照 检测一抗是否正常 阴性对照 检测一抗特异性 空白对照 不加一抗，光加二抗，检测二抗是否发生交叉反应 * 优化条件 电泳分离蛋白质：蛋白抽提，样品制备，电泳 转膜：膜的选择，转膜确认 封闭：封闭液选择，封闭条件优化 漂洗：漂洗液的配制与选择 抗体孵育：抗体选择，抗体稀释倍数优化 底物孵育：恰当的发光或显色底物 曝光：曝光时间掌控 * 打造完美的实验结果 推荐产品 操作步骤 产品 厂家/货号 货号 蛋白提取 cOmplete EASYpack Roche 04693124001 蛋白电泳及转移 miniVE GE 80-6418-77 预染Marker ECL DuaVue Western Blotting Marker GE RPN810 印记膜 Hybond-ECL GE RPN303D Hybond-P GE RPN303F 一抗孵育 www.RnDS Abcam RD 二抗孵育 www.RnDS Abcam RD 检测 ECL GE RPN2109 ECL Plus GE RPN2213 ECL Advance GE RPN2135 * * Western Blotting及常见问题分析 张瀛丹 Western Blotting实验技术 常见问题分析 Western Blotting 免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。 方法一: 直接法 优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非 特异性条带 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 方法二: 间接法 优点： 1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结合位点） 3.多种标记的二抗可供选择 缺点： 1. 交叉反应引起的非特异性条带 2.额外的二抗孵育以及条件优化 电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上 Y 一抗与蛋白结合 Y HRP HRP HRP HRP,AP标记二抗与一抗－蛋白复合物结合 底物与二抗HRP,AP反应,显色或发光 间接Western Blot操作流程 影响Western blotting成功的要素 电泳分离蛋白质：蛋白抽提，样品制备，电泳 转膜：膜的选择，转膜确认 封闭：封闭液选择，封闭条件优化 漂洗：漂洗液的配制与选择 抗体孵育：抗体选择，抗体稀释倍数优化 底物孵育：恰当的发光或显色底物 曝光：曝光时间掌控 第一步：电泳分离蛋白质 合适的裂解方法 防止蛋白质的降解 ——蛋白抽提 定量 电泳 Roche cOmplete EASYpack 第一步：电泳分离蛋白质 Bradford BCA Lowry ——定量 电泳 GE miniVE 梯度胶 水平蛋白电泳 第二步：转膜 膜的选择：NC，PVDF，尼龙膜 转膜方法：半干转、湿转 转