质粒DNA的提取及浓度检测推荐.pptVIP

加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值。260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50?g /ml双链DNA，33?g /ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。 * 记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下: dsDNA=50×(OD260) × 稀释倍数 以上浓度单位为?g /ml * C. 凝胶电泳检测DNA的浓度 0.8%的琼脂糖凝胶，100V,40分钟。 NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder) * 1 kb DNA Ladder虽然不能对DNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大概的量如下（按0.5μg上样量计。应按13条带计算，因为3kb的量是其它片段量的近三倍）： 片段 碱基对 质量 1 10,002 42 ng 2 8,001 42 ng 3 6,001 50 ng 4 5,001 42 ng 5 4,001 33 ng 6 3,001 125 ng 7 2,000 48 ng 8 1,500 36 ng 9 1,000 42 ng 10a 517 42 ng* 10b 500 42 ng* 0.5kb 的条带由500bp和517bp组成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。 * 5. 实验报告 目的与要求 实验原理 材料与方法 结果与讨论 * 实验一 质粒DNA的提取及浓度检测 目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。 * 2. 相关知识及原理 质粒(Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 * * * DNA超螺旋结构 * 细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。 * 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。 质粒类型： * 载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。 具备的条件： 易于鉴定； 在受体细胞中可以独立复制； 易于筛选； 易于导入受体细胞。 * 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) 启始复制子（ori, Origin of replication)； 多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)； 标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。 载体的结构： * Insert EcoRI XhoI 1.9kb * DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。 原理： * SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。 * 细菌裂解的方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。 * 测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是通过凝