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妇产科学专业毕业论文 [精品论文] 人胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究 关键词：糖尿病 人胚胎干细胞 胰岛素分泌细胞 细胞分化 摘要：胰岛移植或β细胞替代是糖尿病最理想的治疗手段，但细胞来源严重匮乏及免疫排斥反应限制了临床的广泛应用。将人胚胎干细胞(human embryonicstem cell，hESCs)诱导为胰岛素分泌细胞，成为β细胞替代物的新资源，为解决细胞来源匮乏带来了希望。已有多种方案由ESCs获得胰岛素分泌细胞，但均存在各种限制，目前仍缺乏将ESCs诱导分化为有功能的胰岛素分泌细胞的最佳方案。探索诱导人hSCs分化为成熟且有功能的胰岛素分泌细胞，并制定出有效而高效的分化方案，成为本课题的主要研究目的。 第一，本研究摸索了在体外培养、扩增、冻存、复苏hESCs细胞株(PKU1)的条件，并对其特异性标志物进行了检测。结果显示，hESCs经多次传代后仍然表达OCT-4和Nanog基因，免疫荧光法显示呈OCT-4、SSEA-4阳性，流式细胞术分析显示，OCT-4、SSEA-4阳性细胞比例分别达89.38％、83.44％；染色体核型分析表明为正常女性染色体核型(46，XX)。 第二，采用酶消化法分离出胎龄14-18W的胎儿胰岛，经悬浮培养、双硫腙(DTZ)染色后种植到组织培养皿中，再以免疫荧光法检测一些细胞标志物的表达。结果显示，悬浮培养条件下，胎龄14-18W的胎儿胰岛细胞聚集成球形细胞簇，呈DTZ阳性，培养液中能检测到一定量的胰岛素和C-肽，贴壁培养后还能检测到胰岛细胞标志物insulin和glucagons及前体细胞标志物PDX-1、CK-19和Nestin的表达，证实14-17W胎儿胰岛已具备一定的胰岛特性和前体细胞的特征。 第三，模拟胰腺发育分化的生理过程，研究设计出五阶段诱导方案，具体如下：(1)．撤除分化抑制因素使hESCs形成拟胚体(EBs)，悬浮培养48h；(2)．将EBs转移至明胶包被的组织培养皿后，加入含Activin A和bFGF及LY294002的诱导培养基Ⅰ诱导5天，向定形内胚层诱导分化。RT-PCR法鉴定SOX17和FOXA2的基因表达，与同期自发分化的EBs进行比较，免疫荧光法检测SOX17的表达。(3)．将细胞转移至laminin包被的培养皿，加入含bFGF、KGF、EGF、GLP-1、尼克酰胺的低血清诱导培养基Ⅱ作用14d，向胰腺前体细胞诱导。RT-PCR法和免疫荧光化学法分别检测前体细胞标志物PDX-1及Ngn3表达。(4)．添加含IGF-1、betacellulin、尼克酰胺、GLP-1、laminin的低血清诱导培养基Ⅲ作用14d，促进胰岛细胞分化，RT-PCR法检测细胞胰岛素基因的表达，免疫荧光化学法检测分化细胞胰岛素和C-肽的表达。(5)．将细胞转移至低黏附性培养皿中，撤除IGF-Ⅰ继续培养3天，促进细胞成熟。应用双硫腙(DTZ)染色液对获得的细胞团进行染色，应用RT-PCR法检测了胰岛素和胰高血糖素基因表达，应用RJA法分别测定了获得的细胞团培养液上清和胞浆中的胰岛素、C-肽含量，并与胎儿胰岛培液上清进行比较，静态培养胰岛素释放试验测定胰岛素与C-肽分泌是否呈葡萄糖反应性。结果(1)．hESCs悬浮培养2d后，形成类球形EBs；(2)．经第二阶段诱导后，细胞表达SOX17和FOXA2基因，且表达量高于同期自发分化的EBs，基本不表达外胚层标志物SOX1，随诱导时间延长，FOXA2表达逐渐增强；免疫荧光化学法显示，诱导5天的细胞胞核呈SOX17。(3)．经第三阶段的诱导，细胞呈上皮样集落，RT-PCR法检测到细胞表达PDX-1、Ngn3及微弱的Pax4基因，免疫荧光法显示细胞呈PDX-1阳性。(4)．经第四阶段的诱导，集落中一部分细胞聚集成多层，RT-PCR显示，不同诱导时期均有胰岛素基因的表达，且随诱导时间延长表达水平逐渐升高；免疫荧光显示，部分细胞呈胰岛素和C-肽阳性。(5)．经第五阶段诱导后，hESCs来源的细胞呈类似胎儿胰岛的胰岛样细胞簇(ICCs)，呈DTZ阳性，RT-PCR检测到Insulin和Glucagon基因表达，RIA法检测到ICCs培液上清中含胰岛素与C-肽，水平与15-17W胎儿胰岛培液上清相近(P＞0.05)，胞浆内的胰岛素和C-肽水平分别为1089.2±217.06μIU/ml和181.33±30.12ng/ml，静态培养胰岛素释放试验验证了ICCs分泌的胰岛素呈糖反应性。 应用五阶段分化方案，hESCs能够有效的分化为具有部分β细胞特性和糖反应性胰岛素分泌功能的细胞，为DM细胞替代治疗提供了有潜力的细胞来源和良好的临床应用前景。  正文内容 胰岛移植或β细胞替代是糖尿病最理想的治疗手段，但细胞来源严重匮乏及免