常用分子实验技术.doc

LB液体培养基： 酵母粉5 g/l，胰蛋白胨 10 g/l，NaCl 5 g/l称取各组分，加入去离子水后用10 mol/l NaOH调pH至7.0，并用去离子水定容。混匀后121°C高压蒸气灭菌25 min。 LBS液体培养基： 酵母粉5 g/l，胰蛋白胨 10 g/l，NaCl 15 g/l称取各组分，加入去离子水后用10 mol/l NaOH调pH至7.0，并用去离子水定容。混匀后121°C高压蒸气灭菌25 min。 LB/LBS固体培养基： 相应的液体培养基加入1.5琼脂粉，倒入锥形瓶，混匀后121°C高压蒸气灭菌25 min，冷却后倒入平板即可。 100ml 1%LB+100 (l Amp+100 (l IPTG+100 (l X-gal 1% (W/V) Trytone 0.5% (W/V) yeast extract 1% (W/V) NaCl 0.1mg/ml Amp 0,024mg/ml IPTG 0.04mg/ml X-Gal 1.5%(W/V) agar 100ml体积 =1% LB+10mg Amp + 2.4 mg IPTG+4mg X-gal 储存：Amp：100mg/ml IPTG：24mg/ml X-gal：20mg/ml LB/Amp培养基：0.1mg/ml Amp Ampicilin(1000×): 100mg/ml Ampicillin 称5g Ampicilin溶于40ml去离子水中，定容至50ml，过滤灭菌，-25度保存。 100×：10mg/ml：1g Ampicillin+ 100ml H2O IPTG 24mg/ml： 1.2g+50ml d H2O，定容，过滤灭均 X-gal 20mg/ml： 1g+40mlDMF(二甲基甲酰胺) 溶解后定容至50ml，分装，-25度冻存 IPTG(238.3)终浓度0.1mM/ 1mM： 称0.2383g（0.4766g）IPTG粉末，溶于去离子水中10ml（20ml），过滤灭菌，分装，得到100mM IPTG 对于终浓度0.1mM 为 1000×浓缩液 对于终浓度1mM 为 100×浓缩液 M9培养及(基础盐培养基) 配每升M9培养基，在750ml无菌去离子水中加入： 5×M9盐溶液 200ml 适当碳源的20%溶液 20ml ，如20% 葡萄糖溶液 灭菌水补足 5×M9盐溶液1L： NaHPO4.7H2O 64g KH2PO4 15g NaCl 2.5g NH4Cl 5.0g 每200ml一份分装后，高温高压灭菌 PBS缓冲液： 137mmol/L NaCl 2.7mmol/L KCL 10mmol/L NaHPO4 2mmol/L KH2PO4 用800ml dd H2O溶解：NaCl 8g， KCL 0.2g， NaHPO4 1.44g， KH2PO4 0.24g；用HCl调pH至7.4，加水至1L，灭菌。 若配置10乘溶液上述数值乘10即可 10(PBS（1L）：NaCl 80g， KCL 2g， NaHPO4 14.4g， KH2PO4 2.4g 0.8%琼脂糖凝胶： 称取0.g琼脂糖溶于40 ml 1(TAE缓冲液中，在微波炉中加热，待琼脂糖完全溶解后迅速倒入制胶台。冷却40分钟后可点样电泳。 10(TAE缓冲液： 将2.42 g Tris碱溶于400 ml双蒸水中，加入5.71 ml冰乙酸和 10ml 0.5 mmol/L的EDTA，定容至1000ml。使用前稀释10倍 (l): 2×Taq酶 25 模板DNA 4 (l 引物F 5 (l 引物R 5 (l ddH2O 11 (l 反应条件如下： 预热 94°C 1 min 模板DNA变性 95°C 30 s 引物退火 ？ 45 s cycles 链延伸 72°C 再延伸 72°C 7 min 反应结束 4°C ∞ PCR产物的电泳分析及回收 配制0.8%琼脂糖凝胶，PCR反应液与10(Loading Buffer混匀后上样，140 V恒定电压下电泳约30 min。电泳完毕后凝胶放入EB染色缸(含0.1% EB)中进行染色，30 min后放入FR-200紫外与可见分析装置中观测电泳结果。 Overlap-PCR Step 1 反应体系(50 (l)：