实验八、总RNA制备 .pptVIP

实验八、总RNA的制备 * 一、概述 中心法则: DNA mRNA 蛋白质 真核生物mRNA的特点: 真核生物的基因中有许多内含子, 需要通过RNA的拼接加工,才能成为成熟的mRNA. 因此真核生物中提取的mRNA , 经反转录合成cDNA, 进而克隆基因已成为分子生物学最重要的方法之一.通常一个典型哺乳动物细胞约含10-5ugRNA, 但其中大部分为 rRNA（28S, 18S及5S）和各种低分子量的RNA(tRNA, 小核RNA等), 只有1-5%为mRNA。这些mRNA的大小和序列不一, 但其3’端有一个poly(A)的结构，它编码了所有由该细胞合成的多肽。 * 实验器皿处理 mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。 人的皮肤、手指、试剂、容器等均可被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。 所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中2000C烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。 为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理。 * RNA酶抑制剂 A. 焦碳酸二乙酯（DEPC）: 强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。但DEPC能与胺与巯基反应，因而含Tris溶液和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制后、然后高压灭菌。 DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物！ B. 异硫氰酸胍（Guanidinium isothiocyanate）: 为目前一种最有效的RNA酶抑制剂。它不但具有败坏细胞结构、核酸从核蛋白质中解离，同时也使RNA酶失活。因此在制备RNA时，缓冲液中常含有异硫氰酸胍。 C. 其它： 钒氧核苷酸复合物（Vanadyl-ribonucloside complex） RNA酶蛋白抑制制（RNasin） SDS, 尿素等 * 二、试验方法 细胞内总RNA制备方法很多，如异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总RNA。  * 酚/SDS法制备总RNA 1、基本原理： 第一步用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，第二步用LiCl选择沉淀去除DNA和其它不纯物。 2、试剂 匀浆缓冲液：0.18mol/L Tris, 0.09mol/L LiCl, 4.5mmol/L EDTA, 1% SDS, pH8.2） TLE： 0.2mol/L Tris, 0.1mol/L LiCl, 5mmol/L EDTA, pH8.2 经平衡的酚 LiCl 3mol/L NaAC 无水乙醇 * 3、实验步骤 植物组织在液氮中磨成粉末，转入含150ml匀浆缓冲液和50ml经TLE平衡的酚的500ml烧杯中. 匀浆2min，加50ml氯仿，温和混匀后，50℃放置20min。 4℃下10000rpm离心20分钟. 水相部分加50ml经TLE平衡的酚, 混匀后加50ml氯仿, 混匀 4℃下10000rpm离心15分钟, 水相部分用加经TLE平衡的酚抽提直至无界面（一般3次）。水相部分氯仿抽提一次 水相部分加LiCl至2mol/L, 4℃下沉淀过夜。 4℃下10000rpm离心20分钟，用2mol/L LiCl冲洗 用5ml水溶解，加LiCl至2mol/L，4℃下沉淀2小时以上。 4℃下10000rpm离心20分钟，用2mol/L LiCl冲洗 用2ml水溶解，加200ul 3mol/L NaAC和5.5ml无水乙醇，-20℃下沉淀过夜 4℃下10000rpm离心15分钟，用1ml水溶解。 * V-gene 总RNA纯化试剂盒 1）．样品收集： 称取200mg新鲜植物叶片，水冲净后用纸巾拭干，剪成碎片，立即浸入液氮，待冷冻完全后边加液氮边碾磨(防止样品融化)，直至组织被碾磨成粉末状。 2）. 样品匀浆 ： 在粉末状植物组织中加入少量液氮，再加500ul R-A溶液，迅速碾磨至R-A溶液融化。 将组织匀浆转入1.5ml离心管，如有较多组织匀浆残留在研钵中，加少量R-A溶液，适当匀浆后收集合并到1.5ml离心管. 冰浴5min。4℃ ， 在12000rpm下离心5