胃癌相关新基因的克隆及生物信息学分析汇总.pdfVIP

课题资助项目 湖南省自然科学基金项目 （课题编号：04C0101） 湖南省自然科学基金项目 （课题编号：09JJ3071） 湖南省教育厅基金项目 （课题编号：08A060） 3 目 录 一、 中文摘要…………………………………………………… 1 二、 英文摘要…………………………………………………… 3 三、 论文正文 前言………………………………………………………… 5 技术路线…………………………………………………… 7 材料与方法………………………………………………… 8 实验结果…………………………………………………… 16 讨论………………………………………………………… 33 结论………………………………………………………… 38 四、 参考文献…………………………………………………… 39 五、 综述 ………………………………………………………… 42 六、 附录一……………………………………………………… 54 七、 附录二……………………………………………………… 54 八、 附录三……………………………………………………… 55 九、 致谢………………………………………………………… 56 4 胃癌相关新基因的克隆及生物信息学分析 研究生：董娟慧 导 师：贺修胜 教授 中文摘要 目的：从胃癌高频率杂合性缺失区域8p21 着手，克隆染色体8p21-22 区域 EST(DA931869)所代表的胃癌相关新基因，初步分析预测该基因的结构及编码的 蛋白质分子与功能，为进一步鉴定胃癌发病相关新基因奠定坚实的工作基础。 方法：收集42例胃癌手术切除新鲜标本，切取胃癌组织为实验组，以远离 癌组织(≥5cm) 胃黏膜组织作为正常对照组，所有样本均经病理学确诊，分别提取 胃癌及正常胃黏膜组织总RNA ，运用RT-PCR方法验证EST 的表达水平；将EST 作为起始序列，通过BLAST分析dbEST数据库，进行电子克隆（in silico cloning ）， 以DNASTAR软件进行序列拼接与延伸，获得该基因的全长cDNA序列；采用生 物信息软件，预测该cDNA序列的开放阅读框，染色体定位，及其所编码的蛋白 质同源性分析，二级结构及其功能预测等；运用染色体步移(Chromosome walking) 技术实验验证EST所代表的未知基因全长序列。 结果：RT-PCR 验证结果：EST 在 42 例胃癌组织中阳性表达率为 40.48%(17/42) ，在正常胃黏膜组织中阳性表达率为 83.33% （35/42 ），两者差异 有统计学意义（p 0.05 ）。 电子克隆及基因结构预测结果：将EST 通过BLAST 进行dbEST 数据库检 索,寻找同源序列进行拼接延伸，第一次延伸往3’端方向延长87bp，随后往5’端 方向依次延长443bp 、343bp、421bp 和473bp ，经五次延伸拼接之后，此cDNA 序列达最大长度为2326bp 。将该cDNA 序列与人类基因组草图大规模测序数据 库中的序列NT-167187.1 进行比较分析，将此 cDNA 精确定位于 8p21，在染色 体上跨度770Kbp （24,080-24,850Kbp ），由3 个外显子和2 个内含子组成。ORF FINDER 在线软件预测最大开放阅读框长度为354bp ，编码117 个氨基酸，起始 密码子预测分值为 0.78 。在线软件预测分析结果显示，于序列 367 位碱基发现 TATA 盒信号：TGTATAAAAA ；加尾信号位于第1932 位碱基：GAAATAAAAT ； 1 在序列202-587 位存在一CpG 岛，G