在利用λ噬菌体构建克隆载体时.PPTVIP

比如将噬菌体感染到具有EcoR I限制-修饰体系的和不具有EcoR I限制-修饰体系的两者宿主细胞中循环生长。用未经修饰的λ噬菌体感染具有EcoR I限制－修饰体系的宿主细胞，那么其子代噬菌体颗粒的产量便会剧烈地减少，为数不多的幸存者，是来源于在感染早期已经发生了修饰作用的λDNA，所以它们可以抵御EcoR I限制－修饰体系的作用。 基因 cⅠ 是 λ 噬菌体的抑制基因，全面抑制并阻断基因的表达，cⅠ 基因的表达促进 λ 噬菌体进入溶源状态，基因 cⅠ 产物活性受到影响会促进 λ 噬菌体进入裂解循环。 在带有 hfl（ 高频溶源化， high frequency of lysogenization）突变 E.coli 中，基因 c Ⅱ 产物可以累积到较高水平。基因 cⅡ 产物为基因 cⅠ 的正调节物，因此 hfl 突变可增加基因 cⅠ 的产物，从而使裂解生长受到抑制，高效地进入溶源状态。 如果外源 DNA 片段插入基因 cⅠ 中，将高频率地使 hfl 突变 E.coli 进入裂解生长状态。 Replacement vectors: Arms and Stuffer(no stuffer ? size is too small for package) 利用lambda噬菌体作为载体的主要特点是它有很高的转化效率，大约比质粒载体高1000倍。另外与质粒载体相比，lambda噬菌体载体有更大的容量。 在利用λ噬菌体构建克隆载体时，必须解决两个难题： （1）λ噬菌体DNA分子仅能再增加5%，也就是说新增加的DNA长度不能超过3 Kb。一旦DNA的总长度超过了52 Kb，它就不能包装进λ噬菌体的头部，即不能形成感染性的噬菌体颗粒。这样就制约了插入DNA片段的长度，限制了λ噬菌体载体的使用。 （2）λ噬菌体的基因组很大，这使得对于每一种限制性内切酶来说，识别位点都不是单一的。这使我们无法按我们的需要去酶切λ噬菌体的DNA分子，因为λ噬菌体DNA会被切成许多小段。 3.3.1 可以从λ噬菌体基因组中移除部分片段 对噬菌体的分析发现，40％的lambda基因组对于噬菌体的溶菌生长是非必需的。这一非必需片段中所包含一些与噬菌体的溶原生长有关的基因。这40％的区段可以被外源DNA片段所取代而不影响噬菌体基因组的复制和结构蛋白。 The nonessential region is removed by restriction endonuclease digestion, leaving a left arm and a right arm. A foreign DNA fragment can be ligated to the two arms in place of the original stuffer fragment, providing maximal insert sizes of over 20 kb. 3.3.2 可以用自然选择来筛选那些缺少酶切位点的λ噬菌体 即使从λ噬菌体的基因组中去掉了那个大片段，对于大多数内切酶来说还是有太多的识别位点。我们通常会在构建一个新的克隆载体时遇到这个问题。 如果仅仅是移出一两个这样的识别位点，我们可以通过体外突变技术来解决。例如，要想去掉一个EcoR I的位点GAATTC，可以把它突变成GGATTC，这样就不会被EcoR I切开。 但是，当初开发λ噬菌体克隆载体时，体外突变技术还相当不成熟，而且，即使在现在，要想改变一个DNA分子上好几个位点，体外突变仍不是一个很有效的方法。 可以用选择的方法来选出缺少那些不需要的酶切位点的λ噬菌体。 此外，它们也可能是在EcoR I位点发生了突变，于是就不能够被EcoR I限制酶所切割。经过在不同宿主之间反复地循环生长之后选择出的噬菌体是缺少全部或大多数EcoR I位点的突变体。 5 EcoRI sites in λ DNA infect E.coli cells very few plaque(3 EcoRI sites) repeat infection with mutant phage few more plaques second mutant phage strain with no EcoRI sites 解决包装限制和多酶切位点后，就可以着手开发基于λ噬菌体的克隆载体了。最先开发出来的两类载体就是λ插入载体(insertion vector)和λ置换载体(substitute vector)。 插入型载体是一种最为简单的lambda克隆载体。在构建插入型载体时，野生型lambda基因组25％的非必需区段被删除。载体本身可以完成生长周期。 插入型载体具有供外源片段插入的单限制性位点。既然插入型载体可以被包装进