复方丹参滴丸对缺氧心肌细胞内.docVIP

中国病理生理杂志. 2001,17(7):690-691 复方丹参滴丸对缺氧心肌细胞内钙离子平均荧光强度的影响 李全凤，王孝铭，朱世军，艾静，高焕焕，徐长庆 （哈尔滨医科大学 病理生理教研室，药理教研室，黑龙江哈尔滨 150086） ［主题词］中草药;荧光；钙;离子；心肌;细胞；低氧 [摘要]目的：探讨复方中药丹参滴丸对缺氧／复氧心肌细胞的保护作用。方法：培养的乳鼠心肌细胞，用钙探针Flou-3/AM染色，利用激光扫描共聚焦显微镜观察心肌细胞缺氧／复氧及在复方丹参滴丸保护作用下心肌细胞内钙离子荧光强度变化．结果：缺氧加丹参保护组，细胞内钙离子荧光强度（1217.78±312.07）明显低于单纯缺氧组（1509.43±508.58）；缺氧复氧加丹参组，细胞内钙离子荧光强度为（1567.91±577.61），亦较缺氧再给氧组（ 1617.6±477.53）低。结论：复方丹参滴丸对缺氧心肌细胞有明显保护作用。 ［中图分类号］ R364.4 ； R285.5 ［文献标识码 ］A 本教研室多年来就复方丹参对缺血／再灌注心肌的保护作用机制进行了大量研究[1-3]，以整体、器官、细胞、细胞器为模型，从形态、能量代谢等不同角度深入探讨。复方丹参制剂可使心肌缺血、缺氧得到明显改善。本实验采用乳鼠心肌细胞培养 36 h，使心肌细胞缺氧／复氧，加入复方丹参滴丸保护，利用共聚焦显微镜观察复方丹参滴丸对心肌细胞缺氧／复氧时的抗“钙超载”作用。 材料和方法 1.试剂 1．1 1 640培养液 美国 Gibco公司产品。 1．2 胎牛血清 中国医学科学院血液病研究所。 1．3 胰蛋白酶 Difco进口分装。 1．4 Fluo-3／AM 日本东京株式会社同仁化学研究所。 1．5 复方丹参滴丸 天津天士力制药集团。 2.细胞分离和培养 取新生的Wistar大鼠的乳鼠（本校动物实验中心提供），在无菌条件下取出心脏，剪碎，加入0．25％胰蛋白酶消化液消化 30min，上清液吸出，用 Hanks液清洗、离心，共 3次。清洗后的细胞用 1640培养液制成混悬液，加入 15％小牛血清，分装培养瓶内，每瓶细胞计数按 106计算。放入 370 C温箱内培养。 3.分组 培养36 h的细胞放在倒置显微镜下观察；视野清晰，细胞生长良好，大部分细胞有搏动。将这些细胞随机分成 5组。①正常对照组（I）； ②缺氧10 min组（II）；③缺氧10 min加丹参组〔Ⅲ〕；④缺氧10min／复氧 10min组（IV）；⑤映氧 10 min／复氧 10 min加丹参组（V）.缺氧组：直接向培养瓶内给氮气10min；缺氧／复氧组：先给氮气10min再给氧气 10min；保护组：给氮气之前将药物加入瓶内，气体流量为每分钟100个气泡（气泡直径为 lmm左右）。复方丹参滴丸终浓度为 40 mg／L。 4.细胞染色 经过处理后的细胞，用 0.25％胰蛋白酶从培养瓶内消化下来，清洗、离心后加入10μmol／ L的Fluo－3／AM染色；在37℃恒温水浴锅内孵育lh。每隔10min振荡 1次，使染液均匀进入细胞内。染色结束后，再用PBS缓冲液清洗，离心，共3次，最后加入无血清，无酚红 1640培养液内，以备扫描。 Fluo-3／ AM是一种新的［Ｃａ２＋］i荧光指示剂，用Fluo－3／AM(戊二酰氧甲基脂)即脂化的 Fluo-3荧光染料负载细胞时，可穿透细胞膜，细胞内的脂酶将其水解，释放出Fluo-3,与细胞内钙离子结合，产生荧光。 5.共聚焦显微镜观察 同Fluo-3/AM染色后的细胞，放在共聚焦显微镜（美国 MERIDIAN公司 INSINGHT PLUS）下，通过显微镜发出的488 nm波长的氩离子激光，激发细胞内与染料结合的游离钙离子，产生荧光。可看到细胞内钙离子分布情况。 6.统计学处理 检测数据以( s表示，用ｔ检验进行分析。 结 果 乳鼠心肌细胞在缺氧 10 min时，细胞内钙离子平均荧光强度增强，为 1509.43士508.58，正常对照组为 1005.75土364.25，两组比较 P0.05；缺氧 10min加入复方丹参滴丸组，与缺氧 10min组比较；钙离于荧光强度减弱，为1217.7士312.07，与正常组比较P0.05，表明丹参对缺氧心肌细胞具有保护作用。而缺氧 10 min／复氧10 min组，与缺氧 10 min组比较,钙离子荧光强度增强为161 7.60士477.53，两组比较P＞0.05；缺氧／复氧加入复方丹参滴丸，钙离子荧光强度无明显减弱，两组比较P＞0.05（见表1）。 表1复方丹参滴丸对缺氧及缺氧／复氧心肌细胞钙离子平均荧光强度影响 Tab 1 Changes in fluorese