肠球菌基因分型及其与耐药性研究进展.docVIP

肠球菌基因分型及其与耐药性研究进展 　　【中图分类号】 R574 【文献标识码】 A 【文章编号】1561-5464(2010)-0 5-0385-03 　　【摘要】 目的 建立随机扩增多态性DNA(random amplified polymorph ic DNA,RAPD)分型技术,对肠球菌进行基因分型,探讨RAPD在分子流行病学中的应用,并 探讨肠球菌的基因分型及其与耐药性的关系。方法 对医院临床标本中分 离的64株肠球菌进行RAPD基因分型,并分析基因型与耐药性的关系。结果RAPD分型结果显示,经优化的RAPD分型技术能有效地对肠球菌进行基因分型,分型率为10 0%。64株肠球菌根据扩增片段的差异分为8种基因型。以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ型为主,共占81.4% 。Ⅰ、Ⅷ型具有对β内酰胺类抗生素和高水平氨基糖苷类抗生素耐药。Ⅳ型具有对β?-内 酰 胺类抗生素耐药。Ⅲ、Ⅶ具有对高水平氨基糖苷类抗生素耐药。Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型具有对β?- 内 酰胺类抗生素、高水平氨基糖苷类抗生素、糖肽类抗生素敏感。结论RA PD分型???术是一种特异、敏感、简便快速、分辨力强、分型率高、重复性好的分型方法。可 有效地对肠球菌进行基因分型,并且肠球菌的RAPD分型与其耐药性有一定关系。 　　【关键词】 肠球菌;随机扩增多态性DNA;基因分型 　　 　　肠球菌的感染和耐药性是目前国内外关注的重要课题和难点。美国疾病控制中心(CDC )医院感染监测系统(NISS)调查表明,肠球菌已成为医院感染的重要病原菌之一,并 且肠球菌的分离率不断上升。尤其多重耐药(MDR)肠球菌的出现,特别是高水平氨基糖苷 类耐药(HLAR)肠球菌以及耐万古霉素肠球菌(VRE)的出现,其耐药性和耐药水平越来越 高,成为抗感染治疗的新挑战。近年来,随着分子生物学技术的发展,具有分辨力强、分型 率高和重复性好的RAPD分型技术已应用于肠球菌的基因分型和相关研究,并显示出较好的应 用前景。RAPD分型法是1990年内Williams和Welsh等建立的一种以PCR为基础的提示基因同源 性和基因多态性的方法,该法最大特点是可对模板序列未知,而随机引物可以是任意的单链 寡聚核苷酸片段。同时可通过在RAPD分型的基础上,进行与其耐药性关系的研究,可在基因 水平上对临床细菌的耐菌性进行测报。因此,肠球菌的基因分型鉴定对于其流行病学分析和 感染控制具有重要意义。为此,我们收集临床分离的64株肠球菌进行RAPD分型技术已应用于 肠球菌的基因分型和相关研究现报告如下。[1-4] 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 菌株 2006年6月至2009年10月本院住院患者的尿液、痰液、大便、 分泌物、胆汁、前列腺液、血液等临床标本中分离的64株肠球菌,已经系统鉴定。 　　1.2 细菌DNA的提取 将64株肠球菌 分别接种于血平板,35℃培养18～24h。用接种 环将菌落分别接种于5ml的普通营养琼脂(LB)液体培养基中,35℃恒温摇床过夜,取1.5ml 菌液离心收取菌体,酚氯仿法抽提后DNA,分光光度法测定抽提后DNA的纯度,A260/A280为1 .82～1.98之间,符合DNA样品要求,置-20℃冰箱保存备用。 　　1.3 RAPD反应体系条件的优化 　　1.3.1 引物的设计 RAPD引物共6条,5条为10bp的引物,1条为9bp的引 物。序列15′-GAAGTCGTLL-3′,序列25′-TCACGCTGCA-3′,序列35′-GGAGGGTGTT-3′, 序列45′-AGGGAACGAG-3′,序列55′-ACGCGLCCT-3′,序列65′-GGGATGGAAC-3′。由上海 生工生物工程公司提供。 　　1.3.2 RAPD引物、Mg2+ 浓度、Taq DNA聚合酶、循环参数 的反应条件优化在 50μl PCR反应体系中含被筛选的随机引物之一2μl(10pmol/L),10×buffer5μl dNTP0. 4μl(0.2mmol/L),Mg2+浓度1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mmol/L,Taq DNA溶酶1.5U 、2.0U、?2.5U、3.0U,DNA模板5.0μl循环参数94℃预变性3min后,再经94℃1min,35 ℃1min,72 ℃2min各35、40、45、50个循环后72℃延伸5min,取5μl扩增产物加上2μl上样6×buffer ,经1.5%琼脂糖凝胶(内含0.5μg/ml EB染料)电泳,85～100V电泳1h,同时用DNA marker 作标准,紫外分析仪下观察并拍照,进行RAPD结果比较,观察RAPD分型指纹图,确定RAPD分 型技术的优化条件反应体系。循环参数为94℃预变性,再经94℃1min、35℃1mi