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微生物学教研室 菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序,该工序又称为种子制备。 菌体数量增加 种子制备 高质量的种子 种子的扩大培养任务： 获得纯而壮且活力旺盛、接种数量足够的培养物。 发酵时间长短和接种量的大小有关。 将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，有利于缩短 发酵时间，提高发酵罐利用率，减少染菌机会。 一、种子制备的过程 1、固体培养基上生产大量孢子的孢子制 备 2、液体培养基中生产大量菌丝的过程 1、孢子制备 孢子制备是种子制备的开始，孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖、发酵产量有明显影响。 （1）放线菌孢子的制备 限制碳源、氮源（碳源1％，氮源不超过0.5％）；添加麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨、无机盐；干燥。 放线菌发酵生产的工艺流程： 菌种 母斜面 子斜面 摇瓶种子 种子罐 发酵罐 （孢子） （孢子） （菌丝） （2）霉菌孢子的制备 一般以大米、小米、玉米、麸皮等天然农产品为培养基 （3）细菌培养物的制备 斜面多为碳源限量、氮源丰富的配方 2、种子制备 种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。 （1）摇瓶种子制备：某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子。分母瓶和子瓶。 （2）种子罐种子制备：因菌种不同而异，一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 A、一级种子：孢子或摇瓶菌丝被接入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量菌丝。一级种子转入到发酵罐内发酵，称为二级发酵。 B、二级种子：将一级种子转入体积较大的种子罐中，经过培养形成更多的菌丝。二级种子转入到发酵罐内发酵，称为三级发酵。 C、三级种子，四级发酵 种子罐的级数主要决定于菌株性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用。 二、种子培养 表面培养法：好氧静置 培养法 固体培养法：曲法培养 液体深层培养 液体深层培养 液体深层种子罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌浆叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法，称为深层培养法。 深层培养基本操作的三个控制点： Ⅰ灭菌 Ⅱ温度控制 Ⅲ通气、搅拌 几种深层培养法 （1）控制培养法：根据罐内部的变化情况，掌握 短时间内状态变量的变化以及可能测定的环境 因子对微生物代谢活动的影响，以此为基础 作控制培养，以达到产物的最优培养条件。 （2）载体培养法：以天然或人工合成的多孔 材料代替麸皮之类的固体基质作为微生 物的载体。 （3）两步法：酶制剂的两步深层培养中，将 菌体生长（营养期）和产酶条件（繁殖 期）区分开。 三、种子质量控制 种子质量主要受孢子质量、培养基、培养条件、种龄和接种量等因素的影响。 种子的质量是发酵能否正常进行的重要因素之一，因为种子制备不仅是要提供一定数量的菌体，更为重要的是要为发酵生产提供适合发酵、具有一定生理状态大的菌体。种子质量的控制将以此为出发点。 三、种子质量控制 1、培养基：尽量选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基；营养成分要尽可能和发酵培养基相近。 2、培养条件：最适温度；通气搅拌的控制。 青霉素生产：通气充足和通气不足的种子都接入发酵罐，发酵单位可相差一倍。 土霉素发酵生产：一级种子罐通气量小却有利。 搅拌不足会引起菌丝结团、菌丝粘壁等异常 3、种龄：即种子培养时间。一般选对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。 最适种龄：细菌——7～24h； 霉菌—— 16～50h； 放线菌——21～64h 同一菌种的不同罐批培养相同的时间，得到种子质量也不完全一致，因此最适的种龄更应通过多次试验，根据本批种子质量来确定。 4