第五章 细胞培养.ppt

第五章 细胞培养植物细胞培养（plant cell culture）是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术根据培养规模:小规模培养和大批量培养；根据培养方式:悬浮培养、单细胞培养等；根据要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养。  §1.单细胞分离 §2.悬浮培养 §3.单细胞培养技术 §4.植物细胞大规模培养与次生产物生产 §1.单细胞分离由完整的植物器官分离单细胞由培养组织中分离单细胞 1、由完整的植物器官分离单细胞叶片是分离单细胞的最好材料机械法酶解法 只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。 §2.细胞悬浮培养(cell suspension culture) 一、细胞悬浮培养的概念和意义 悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。 1、细胞可以不断增殖，形成高密度 的细胞群体，适于大规模培养；2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。 三.细胞悬浮培养的方法1、培养基对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的培养基以原愈伤组织继代时的培养基除去琼脂为好。为了提高细胞的分散度，对于生长素和细胞分裂素的比例需要进行一些调节。 2、培养细胞的起始密度及细胞记数（1）最低有效密度的概念 在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细胞能够增殖的最少接种量称为最低有效密度或者临界的起始密度。 最低有效密度由于培养材料、原种培养条件，原种保存时间长短、培养基的成分不同而有差异，一般为104~105细胞/ml （2）细胞记数要保证细胞培养的最低有效密度，在细胞游离后要对分离的单细胞进行记数，可用血球记数板。 （3）活细胞测定除测定细胞密度外，尚需要测定活细胞率以作为测定起始密度的参考活细胞率（%）=（5个视野中的活细胞数/5个视野中的细胞总数）*100%  活细胞测定的方法；A、醋酸酯荧光素（FDA）染色法FDA本身无荧光，无极性，可自由通过原生质体膜进入细胞内部，进入后由于受到活细胞内脂酶分解，而产生有荧光的极性物质荧光素，不能自由出入原生质体膜，在荧光显微镜下观察到荧光的是有活力的，反之无活力。具体操作：取0.5ml细胞悬浮液放入到小试管中，加入FDA溶液，使最后浓度达到0.01%，混匀，室温下作用5min，荧光显微镜观察。 B、酚藏红花染色法先配制0.1%酚藏红花溶液，溶剂为培养液。检查时将悬浮细胞取一滴放在载玻片上，滴一滴0.1%酚藏红花，盖上盖玻片，染成红色的是死细胞，无色的是活细胞。 3、悬浮培养细胞数目的增殖变化 细胞生长各个时期的特点：滞后期（延迟期）:细胞很少分裂，其长短与接种量 大小和继代时原种细胞所处的生 长期有关对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速 率保持不变直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢 物质增多，氧气减少静止期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少， 甚至开始死亡。 讨论: A、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。B、加入条件培养基可以缩短滞后期。 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。C、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。D、如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。 操作注意事项：对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2- 4细胞），使用吸管或注射器。继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。 4、细胞生长的测定对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进行动态的测定，以掌握其生长的基本规律，为继代培养或其他研究提供依据。A、细胞记数注意：由于悬浮培养的细胞并不会呈游离单细胞，因此 通过培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞记数。可用5%~8%铬酸或0.25%的果胶酶对细胞团进行处理生长速率pP=（lnx-lnX0）/tX为t时间的细胞密度，X0为起始细胞密度 B、细胞大小的测定技术（用显微测微计）C、细胞体积：将一定量的细胞悬浮液放入放入15ml刻度离心管中于2