高中人教版生物选修1专题5　DNA和蛋白质技术《课题3血红蛋白的提取和分离》（53张ppt） （共53张PPT）.ppt

3、纯化（凝胶色谱操作） （1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平 ②底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底 注意事项： ③顶塞的制作 打孔 安装玻璃管 ④组装 将上述三者按相应位置组装成一个整体 （2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择 A、材料 “G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克 B、代表意义： 交联葡聚糖凝胶（G-75） 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液 ②凝胶的前处理 ③凝胶色谱柱的装填方法 A、固定 B、装填 将色谱柱处置固定在支架上 将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀 注意： 2、装填凝胶柱时不得气泡存在： 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙 思考:你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？ 1、分离生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 2、 蛋白质分离和提取的原理 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质 新课引入 蛋白质的提取 3、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种特性，作用结果是什么被破坏？ 变性、变性，空间结构 4、人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富（红色）便于提取血红蛋白 一.基础知识 （一） 凝胶色谱法 1、别名：分配色谱法 根据被分离物质的相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用来分离蛋白质的有效方法. 2、概念： ①大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道 3、凝胶色谱法的原理—分子筛效应 ③分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离 ②当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢 5、具体过程 相对分子质量的大小 4、依据的特性 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 （二）缓冲溶液 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变 1、作用 2、缓冲溶液的配制 通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液 思考：在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？ 使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性) （三）电泳： 1、概念 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 2、原理 ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电 ③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 3、常见方法 琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳 4、实例 十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 ①应用 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素 ②原理 ③ SDS作用 为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS ,SDS能与各种蛋白质形成复合物。SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小 二、实验操作 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定 1、样品处理 （一）蛋白质提取和分离步骤 血液组成 （二）操作过程 血液 血浆 水分 固体物质 血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （90％） 两个a－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团 ①成分 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素