土贝母苷甲对体外培养肝癌细胞(hepg2)抑制作用及其相关机制的研究-生物医学工程专业论文.docx

中文摘要摘要肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是当今世界常见的恶性肿瘤之 一，其死亡率占世界肿瘤中的第3位，每年全球大约有550，000个新增肝癌病例， 超过所有恶性肿瘤的5％，但是目前临床上的治疗结果仍然不容乐观。因此探寻更 有效的治疗方法是目前迫在眉睫之事，而传统中药则因其固有的优点无疑是研究 肝癌治疗新药物的重要资源。近年来就发现传统中药中的土贝母是一种有效的抗肿瘤药物。土贝母 Bolbostemma paniculatum(Maxim．)Franquet(Cucurbitaceae)为葫芦科假贝母属植 物，很早就在中国被广泛用于炎症、蛇毒等的治疗，1765年出版的《本草纲目拾 遗》中已有记载。土贝母被发现具有较强的抗癌作用后更是受到广泛的关注，并 从中成功提取出了有效成分，土贝母苷甲。土贝母苷甲是一种三萜皂苷，已经有 实验证明土贝母苷甲可以抑制体外培养的多种人类癌细胞的生长，包括人早幼粒 白血病细胞株(HL．60)、子宫颈癌细胞株(HeLa cells)和鼻咽癌细胞株(CNE．2Z) 等癌细胞。这些体外研究结果都提示土贝母苷甲有可能是一种有效的抗癌药物成 分。然而土贝母苷甲对肝癌的抗肿瘤活性尚未见报道，而且动物模型的药代动力 学显示，土贝母苷甲在肝脏中的含量最高，所以土贝母苷甲很有可能对肝癌的治 疗效果更佳。因此，有必要研究土贝母苷甲对肝癌的抗肿瘤活性及其相关机制。本课题主要针对体外培养的人肝癌细胞株HepG2细胞，并以正常肝细胞株 L．02细胞作为对照，研究了土贝母苷甲对肝癌细胞生长的抑制作用。同时，鉴于 肿瘤的发生发展除了因为细胞增殖和分化异常外，细胞凋亡异常也是关键的机制， 进一步研究了土贝母苷甲诱导HepG2细胞凋亡的分子生物学机制。另外，本课题 还研究了土贝母苷甲对肝癌细胞的迁移、侵袭、细胞骨架刚度等生物力学行为或 性质的影响，并对相应的作用机制进行了初步探讨。这些研究为更全面深入地认 识土贝母苷甲作用于肝癌细胞，如HepG2细胞的过程和机制奠定了基础，为进一步研究土贝母苷甲用于临床治疗肝癌提供了一定的理论依据。本课题研究取得的主要结果如下：①土贝母苷甲抑制体外培养的肝细胞的生长：采用MTT法试验的结果表明， 土贝母苷甲对体外培养的人肝癌细胞(HepG2、HCCLM3)和正常肝细胞(L-02、 QSG一7701)的生长均有抑制作用，并呈明显的时间依赖性和剂量依赖性。重要的是，肝癌细胞和正常肝细胞对土贝母苷甲的抑制作用表现出不同的响应，尤其是在10—30pM的浓度范围内，肝癌细胞对于土贝母苷甲作用的敏感性显著地高于正 常肝细胞。流式细胞术检钡iJHepG2细胞的细胞周期结果表明土贝母苷甲对肝癌细胞重庆入学博十学位论文增殖的抑制可能与药物将细胞阻滞于G2／M期有关。②土贝母苷甲诱导肝癌细胞的凋亡：采用相差细胞显微术和Hoechst33258染 色剂标记细胞核的实验发现，经过不同浓度的土贝母苷甲处理后，HepG2细胞出现 形态皱缩、变圆，细胞核染色质浓缩、断裂等典型的凋亡形态学改变；采用 Tubulin．Tracker荧光探针标记的细胞微管骨架也由不加土贝母时明亮的红色荧光、 从细胞中心发射状排列分布到出现细胞周围荧光强度减弱、无定形排列、细胞膜 易位、细胞形态变圆等显示细胞微管骨架解聚的现象。流式细胞术检沏,lJAnnexin WPI双染色法标记细胞的检测结果显示，随着土贝母苷甲浓度的增加，HepG细胞 和L．02细胞中早期凋亡和晚期凋亡的细胞数量都相应增加，但是在较低浓度时(e．g． S15“M)时，早期凋亡的细胞比例与晚期凋亡的细胞比例差别并不明显，当浓度较高(e．g．=30州)的时候，早期凋亡的细胞比例远远超过晚期凋亡的细胞比例，暗示土贝母苷甲在较高浓度的时候可能更倾向于促进细胞的早期凋亡。另一方面， 在同等浓度下，土贝母苷甲对HepG2细胞凋亡的诱导作用要大于对L．02细胞的作用，这与其对细胞增殖的抑制作用结果相一致。采用流式细胞术和Western blotting等的实验结果表明，HepG2细胞在经过土贝 母苷甲作用后，其线粒体膜电位下降，细胞色素c从线粒体中释放到细胞浆中，caspase．3和．9的活性增高，抗凋亡蛋白Bcl．2表达降低，而促凋亡蛋f3Bax的表达升 高，以及Bax和Bcl．2表达的相对比率不断增高等。这些结果说明了线粒体途径参与了土贝母苷甲诱导的HepG2细胞凋亡过程。⑨土贝母苷甲抑制肝癌细胞迁移与侵袭：肿瘤细胞的转移和侵袭是恶性肿瘤 的主要生物学特征，也是直接影响肝癌患者治疗效果和预后的重要原因。本课题 的研究显示，土贝母苷甲可以有效抑制HepG2细胞的迁移与侵袭。采用对细胞 F-actin骨架的荧光染色和共聚焦显微镜观察显示，经土贝母苷甲作