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消毒技术规范（二） 2? 消毒检验技术规范 2.1 消毒检验技术规范 2.1.1 消毒剂杀微生物试验技术 2.1.1.1 适用范围 本章内容主要适用于消毒剂鉴定和日常监测，用来评价各种用途的消毒剂对微生物的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒剂的杀菌能力的重要方面进行验证，侧重反映消毒剂的实用剂量与杀菌能力。不能反映消毒剂的全面特性。 2.1.1.2 菌悬液与菌片的制备 2.1.1.2.1 适用范围 制备消毒剂杀菌试验用细菌悬液与菌片，以供消毒剂杀菌试验时使用。 2.1.1.2.2 试验器材 （1）菌种:金黄色葡萄球菌ATCC 6538，作为细菌繁殖体中化脓菌的代表；绿脓杆菌ATCC 15442，作为医院感染中最常分离的细菌繁殖体的代表；大肠杆菌8099，作为细菌繁殖体中肠道菌的代表；枯草杆菌黑色变种ATCC 9372，以其芽孢作为细菌芽孢的代表；龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC 93326，作为人结核分枝杆菌的代表；白色葡萄球菌8032作为空气中细菌的代表。在上述规定的菌株基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。 （2）有机干扰物：见附录A。 （3）磷酸盐缓冲液：见附录A。 （4）无菌蒸馏水。 （5）稀释液：见附录A。 （6）细菌培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）等，见附录A。 （7）革兰染色液：见附录A。 （8）芽孢染色液：见附录A。 （9）恒温水浴箱。 （10）玻璃漏斗。 （11）刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。 （12）数字可调移液器（10μl, 20μl, 100μl,200μl,1000μl）及配套用一次性塑料吸头。 （13）离心机。 （14）电动混合器 （15）浊度计。 2.1.1.2.3 细菌悬液制备程序 （1）细菌繁殖体悬液的制备 1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0ml 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37 ℃ 培养18h～24h。 用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于 37℃ 培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于 37℃ 培养 18h～24h，即为第3 代培养物。 2）取菌种第 3代～14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲 80 次，以使细菌悬浮均匀。 3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。 4）细菌繁殖体悬液应保存在 4℃ 冰箱内备用。应当天使用不得过夜。 5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。 （2）细菌芽孢悬液的制备 1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5 ml～10ml 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃ 培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于 37℃ 培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于 37℃ 培养 18h～24h，即为第 3 代培养物。 2）用 5.0ml 吸管吸取 5.0 ml～10.0ml 第 3代～5代的 18h～24h 营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，置于37℃ 温箱内，培养 5d～7d。 3）用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检。当芽孢形成率达 95% 以上时，即可进行以下处理。否则，可再在室温下放置一定时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。 改良芽孢染色法：①用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。②将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的 5.0% 孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放54℃～56℃ 条件下，加热 30min。取出，去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。③加0.5% 沙黄水溶液，染1min。水洗，待干后镜检。芽孢呈绿色，菌体呈红色。 4）罗氏瓶培养物，用 10.0ml 吸管加 10.0ml 无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以 L 棒轻轻推刮下菌苔。 吸出第一批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加 5.0ml 无菌蒸馏水，重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，