反胶团萃取试验研究表明.PPT

19 双水相萃取 19.1 双水相的形成 亲水性的聚合物溶液 熵增——混合——自发 分子间作用力------随着Mr的增加,而增大. 聚合物的不相容性------含有聚合物分子的溶液发生分相的现象. 相图:相平衡时物系的组成,温度与压力的关系. 19.1 双水相的形成 双水相系统(aqueous two-phase system, ATPS) 19.2 ATPS相图 双节线(bi-nodal)： 图中的曲线。双节线以下的区域为均相区,以上的区域为两相区，即ATPS 。 系线(tie line)： 双节线上两点的直线。 系线反映的信息 A 杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同，而体积不同的两相。两相体积近似服从杠杆规则 B 性质差异：系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小. C 临界点(critical point)：当系线长度趋于零时, 两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如K点。 19.3 蛋白质的分配平衡 1)分配系数m 2)m贡献因子 me、mb和ma分别为静电、疏水和亲和作用对溶质m的贡献. 3)、静电作用 非电解质型溶质:电中性蛋白质的m0： 式中, M: 溶质分子量; ??: 溶质在上下两相表面自由能的差, J/mol。 意义： A 不受静电作用的影响(因不带电); B 一般?? 0，不同溶质lnm随M? 而?； C ATPS不同, 同一溶质的??也就不同，m随ATPS不同而改变。 图是不同pro在pH为各pro的pI的ATPS中的m, 道南电位(??, Donnan potential) 实际ATPS中有电解质, 当这些离子在两相中m ? 1), 将两相间产生电位差?? 带电pro的m: 意义： A 荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比. B 由于同一ATPS中添加不同的盐产生的??不同,故m与Zpro的关系因盐而异。 4)疏水作用 相间疏水因子(HF, hydrophobic factor) PEG/DX和PEG/KPi等ATPS上相(PEG相)疏水性较大,相间的疏水性差用HF表示. HF可通过测定疏水性已知的aa在其pI处的maa测算: RH-aa相对疏水性(relative hydrophobicity).是通过测定aa在水和已醇中溶解度的差别确定的,并设疏水性最小的Gly的RH=0.所以,上式中的B为: mGly为Gly分配系数. 所以, pH=pL时aa在ATPS中的分配系数与其RH值呈线性关系,直线的斜率就是该双水相系统的HF值.图为测定实例. Pro表面疏水性(HFS, HF of surface) 利用上式可确定不同ATPS的HF值.如在pH = pI的ATPS中, pro的m0与HF值之间呈线性关系, 则直线的斜率定义为该蛋白质的HFS 图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。图的结果示：pro的HFS随NaCl浓度的增大而增大。将盐对pro的HF影响上式得： 其中?HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。因此，m的一般形式 19.4 影响蛋白质m的综合因素 1)成相聚合物浓度和分子量 分子量M: 若降低聚合物的M，则pro分配于富含该聚合物的相中。如PEG/DX系统，若降低DX的M，则m减小。这一规律具有普遍意义。 成相系统的总浓度：增大时,系统远离临界点,系线长度增加,两相性质的差别(疏水性等)增大,蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值(m=1),即大于1或小于1.因此,成相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质越容易分配于其中的某一相. . 存在问题：当系线长度增加时,系统的表面张力增大,可能导致溶质在界面上的吸附.这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,.但对于可溶性蛋白质.这种界面吸附现象很少发生,一般可不考虑。 2)盐 ??：图为各种离子在PEF/DX系统中的m. 图示：HPO42-和H2PO4-(H1.5PO4-1.5)离子在PEG/DX系统的m小, 因此利用pH 7的磷酸盐buffer很容易改变??,使带负电pro有较高的m. ?HFS：盐的种类和浓度影响pro的?HFS, 从而影响pro的m。当盐的浓度很大时(如1mol/dm3), 由于强烈的盐析，蛋白质的溶解度达到极限，表现分配系数增大，此时m与pro浓度有关。利用这一特点，通过调节ATPS盐浓度，可选择性萃取不同的pro。 不良影响：改变各相中成相物质的组成和相体积比。如PEG/Kpi系统中上、下相(或称轻重组)的PEG和磷钾浓度。 3)、pH value A B 交错分配法(cross pa