目的基因分离小结.ppt

4. 目的基因的分离 原核生物基因的组成——操纵子 1、基因区： 2、启动区 在mRNA 起始密码子AUG上游10个碱基左右处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3’端识别互补，帮助从起始AUG处开始翻译,称为SD序列(SD sequence) 重叠基因（overlapping genes） 重复基因（repeated genes） 不重复的唯一序列（1个拷贝） 低度重复序列（小于10个拷贝） 中度重复序列（10-几百个拷贝） 高度重复序列（几百-几百万个拷贝） 加倍基因 基因重排 目的基因的制备 直接分离法 限制性核酸内切酶酶切分离法 基因分离的物理化学法 原理——根据目的基因的理化性质、碱基组成等的不同分离基因。 方法——密度梯度离心法 单链酶解法 分子杂交法 双抗体免疫法 酶促反转录法 构建基因组文库 N=ln（1-P）/ ln（1-f） N：基因组文库必需的克隆数目 P：文库中目的基因出现的概率（99%） f：插入片段大小于基因组大小的比值 构建λ噬菌体基因组文库的步骤 构建YAC基因组文库 cDNA文库的构建过程 1. 分离细胞总RNA，并纯化mRNA。 2.以mRNA为模板，合成cDNA第一条链 Oligo（dT）引导的cDNA合成 随机引物引导的cDNA合成法：利用多个由6-10个核苷酸组成的随机引物。 3. 双链cDNA的合成 （3）Oligo（dG）寡聚引物引导法合成双链DNA：用Oligo（dG）直接引导合成第二条链。 4. 将合成的双链cDNA重组到质粒或噬菌体载体上，导入大肠杆菌增殖 RACE（rapid amplification of cDNA ends） ——以mRNA为模板，反转录合成cDNA的第一条链，用PCR技术扩增出从某个特定位点到3‘或5’末端的核苷酸序列。 包括：3‘RACE和5’RACE。 ——特定位点指cDNA基因内位点，其引物叫基因特异性引物（gene-specific primer）GSP。 利用PCR反应技术扩增目的基因 （1）套式PCR（nested PCR） （2）反向PCR（inveerse PCR） （3）不对称PCR（asymmetric PCR） （4）锚定PCR（anchored PCR） （5）长程PCR（long and accurated PCR） （6）反转录PCR（RT-PCR） （7）锅柄PCR（panhandle PCR） （8）Alu PCR （1）套式PCR（nested PCR） 2对引物扩增同一样品，其中1对引物处于另一对引物内。 分内部引物、外侧引物 先用外侧引物扩增长DNA序列，以此为模板，以内部引物扩增出适当的DNA片段。 特异性强 （2）反向PCR（inverse PCR） 根据已知DNA序列设计2个引物，扩增出这已知靶序列的两端未知DNA片段。 过程：首先用RE消化待侧DNA片段，用连接酶使片段自我环化，酶切已知序列，并用已知DNA序列设计2个引物扩增出这已知靶序列的两端未知DNA片段。 （3）不对称PCR（asymmetric PCR） 扩增中2个引物的浓度不同。 当低浓度引物用尽后，会产生特异性单链DNA。 单链DNA——用于DNA序列分析。 制备杂交探针 （4）锚定PCR（anchored PCR） 又叫单侧PCR，指通过添加锚定引物接头的方式来扩增未知序列的方式。 首先逆转录合成cDNA，在cDNA的3‘端加上poly（dG）尾。 用锚定引物poly（dC）扩增cDNA片段 通常锚定引物与基因特异引物共用扩增DNA片段。如RACE技术 （5）长程PCR（long and accurated PCR） 用PCR技术扩增大片段DNA，10kb以上，是普通PCR的10倍。 采用LA或EX Taq聚合酶，延长复性和延伸阶段的时间。 引物长度应30-35bp，是正常引物的2倍。 （6）反转录PCR（RT-PCR） 首先mRNA反转录，然后以cDNA为模板，用特定PCR引物扩增出目的DNA片段。 包括连续RT-PCR和长距离RT-PCR。 克隆mRNA的cDNA拷贝的重要步骤。 RT-PCR具有高敏感性。 （7）锅柄PCR（panhandle PCR） （8）Alu PCR Alu序列是人类基因组DNA中的特异性重复序列，根据Alu 序列设计引物，来扩增2个Alu 序列之间的位置序列。 PCR技术的发展 原位PCR（in site PCR, IS-PCR） 荧光定量PCR（real-time PCR） 基因的化