人教版高中生物选修1专题五课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段课件共23张PPT.ppt

一个指纹一份DNA两劫匪现形 在一个抢劫案中，办案人员从现场提取到一男性个体的DNA和一个指纹。这两份线索最终将两罪犯抓获。 多聚酶链式反应(PCR技术) 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。 穆利斯( K.B.Mullis ) 1944~? 脱氧 核糖 含氮碱基 磷酸 A G C 1 2 3 4 5 O 5 那么DNA分子的平面结构怎样呢？ 知识回顾 脱氧核苷酸 T DNA分子的平面结构 A T G C A G C T 氢键 5端 3端 5端 3端 （磷酸基团） (-OH端) 思考：体内DNA复制的条件是什么？ 体内DNA复制 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′ 端开始连接脱氧核苷酸 一、PCR原理 DNA复制的方向 DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸 5/ 3/ 5/ 3/ 引物 子链 使DNA聚合酶能够从 引物的3′ 端开始连 接脱氧核苷酸 母链 DNA双链 单链 变性（加热80-100℃ ） 复性（缓慢冷却） 变性的目的： 复性的目的： 解开双链 有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合 体外扩增DNA如何打开双链？ 耐高温的DNA聚合酶 高温会使DNA聚合酶失活 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 3/ 引物Ⅰ 5/ 3/ 引物Ⅱ 变性95oC 复性55oC 延伸72oC 5/ 3/ 3/ 5/ 二 PCR的过程 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 高温变性 低温复性 重复1~3步30轮 步骤：变性——复性——延伸 5? 引物1 5? 引物2 第二次复制 第一次复制 5? 5? 5? 5? 5? 5? 模板DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a×2 n 三、 PCR反应的实验操作 1.准备（按配方将所需试剂摆放在实验桌上） 2.移液 （用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分） 想一想 在ＰＣＲ反应中如何设置对照？ 3.混合（盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁） 4.离心 （将微量离心管放在离心机上） 5.反应 将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序 预变性：　94°C　５min　 变性：　　９4℃，30s 　３０个循环 复性：　　55℃，30s　 延伸：　　72℃，1min 延伸： 　72℃，2min 保存：　４℃，１ｈ 实验中DNA含量的测定 1 、原理 可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关 四、结果分析与评价 2 、过程 稀释 2μL PCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释 对照调零 以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零 取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值 测定 DNA含量（?g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数 计算 50：在厚度为1cm比色杯中，OD260=1相当于50?g /ml的双链ＤＮＡ。 体内DNA复制 在DNA复制中的作用 高温使DNA变性,双链全部解开，不需解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′ 端开始连接脱氧核苷酸 体内DNA复制与PCR的技术区别： 解旋酶 TaqDNA聚合酶 PCR的技术 课堂小结 多聚酶链式反应扩增DNA片段 PCR原理 DNA的复制需要酶、原料、能量、引物 DNA的变性和复性受温度影响 PCR过程 变性 复性 延伸 操作步骤 准备 移液 混合 离心 反应 测定含量 稀释 调零 测定 计算 １、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？ 从子链的5’端向3’端延伸 练习巩固 2、下图表示的是DNA扩增中那次循环的产物（ ） A：第一次循环 B：第二次循环 C：第三次循环 D：第四次循环 * *