利用磁微粒化学发光平台开发检测结核分枝杆菌试剂.pdfVIP

摘要 摘要 结核病是由结核分枝杆菌复合群(简称结核分枝杆菌或结核菌) 引起的慢性 感染性疾病，由于仅有 10%左右的结核菌患者会发展成活动性结核病，90%的 患者为潜伏性结核菌患者，发展出能检测出潜伏性结核菌患者的方法，更为迫 切，及早的治疗好患者隐藏的病患，是对患者负责，也是对患者的家人和全社 会负责。 本研究完成检测结核分枝杆菌试剂盒（磁微粒化学发光法）的研制和开发， 试剂盒各项性能指标符合要求，经过临床符合性评价，可用于检测患者的潜伏 性结核和活动性结核的诊断。 研究方法： 1.制备γ-干扰素（IFN- γ）的单克隆抗体，筛选出反应性最高，灵敏度、 特异性最好的抗体配对，同时筛选出适合用于包被的单克隆抗体和适合用于标 记的单克隆抗体。 2 、针对包被抗体，筛选出反应性最佳、经 37℃10 天破坏，反应性保持稳 定的磁微粒包被方法、活化方法及保护蛋白种类，使γ-干扰素（IFN- γ）单克 隆抗体与载体磁微粒能够紧密的连接。 3、针对标记抗体，建立反应性最佳，经 37℃10 天破坏，反应性保持稳定 的酶结合物稀释液缓冲体系和保护蛋白种类，实现检测信号的放大。 4 、在 2 、3 步骤基础上，评价开发试剂的相关性能，实现患者结核分枝杆 菌的快速检测。 研究结论： 1、针对制备的γ-干扰素单克隆抗体结果表明，筛选出了 14 株能够分泌γ -干扰素的单克隆抗体的杂交瘤细胞，经细胞计数、扩大培养，培养适量的杂交 瘤细胞注射入小鼠的腹腔中，获取腹水，经蛋白纯化后获得单克隆抗体。将这 14 个单克隆抗体经包被和辣根过氧化物酶标记后选出最优的配对组合即 1#包 被抗体与 3#酶标抗体。 2 、磁微粒包被方法的结果是羧基两步法，活化时间 1h±5min，包被抗体 浓度 0.1ug/人份，包被时间 1h±5min，封闭液为 pH 7.4 0.02M PBS+1% 的 I 万方数据 摘要 casein+1‰的 ADP+2‰的 PC-300 。后经过37℃10 天的破坏性考核，与 4 ℃条件 下反应性基本一致。 3、酶结合物的确定结果显示不同缓冲液的差别不大，但不同蛋白影响较大， 从缓冲液角度对比，不论哪种蛋白，8# 配方的稳定效果较好，经过 37℃10 天 的稳定性放置，8#配方稳定性最好，因此选择 8#配方为最终酶结合物稀释液的 配方。 4 、校准品稀释液确定结果显示 1#校准品稀释液配方在反应性、冻干前后 稳定性、融解后稳定性和 37℃10 天的热稳定性方面均能保持很好的性能，因此 选择 1#校准品稀释液配方。 5、反应体系的确定结果为 37℃反应 30min，双抗体夹心一步法。 6、本临床研究共检测结核病患者样本260 例，研究试剂检出 215 例阳性， 灵敏度为 82.69%；119 例非结核性肺部疾病患者和其他患者样本共检出阴性 99 例，特异性为 83.19%。研究试剂与参比试剂的阴性符合率为90.20% （95%CI： 87.44%~93.52%）；阳性符合率为91.07% （95%CI：88.10%~94.01% ）；总符合 率为 90.77% （95%CI：87.79%~ 93.78%）。通过对临床病人的全血进行刺激和 分析，该研究的针对结核病患者灵敏度已达到 82.69% ，特异