纤溶酶原激活物抑制剂-1sirna抗搏来霉素诱导的大鼠肺纤维化作用及机制-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 中文摘要纤溶酶原激活物抑制剂． 中文摘要 纤溶酶原激活物抑制剂．1 siRNA抗博来霉素诱导 的大鼠肺纤维化作用及机制 摘 要 研究背景及目的：特发性肺纤维化(IPF)病理早期表现为肺泡炎， 晚期成纤维细胞转化为表达平滑肌肌动蛋白a(Q．SMA)的肌成纤维细胞， 细胞外基质(ECM)过度沉积。减少肺间质内ECM沉积，促进其降解是 IPF治疗的关键环节。降解细胞外基质的两种主要酶类是纤溶酶和基质金 属蛋白酶(MMP)。纤溶酶原激活物抑制剂．1(Plasminogen activator inhibitor-1，PAl．1)通过灭活尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及组织型纤 溶酶原激活物(tPA)，抑制纤溶酶形成和MMP活性，促进ECM沉积和 肺纤维化的发展。近年研究表明，PAI．1可能作为独立因素促进器官纤维 化的发生、发展，如：过表达PAI．1可能加重正常皮肤和瘢痕皮肤成纤维 细胞胶原沉积；PAI．17的小鼠博莱霉素诱导的肺纤维化程度减轻。因此， 我们设想通过下调肺纤维化过程中PAI．1的表达达到治疗肺纤维化的目 的，并初步探讨其发挥作用的信号途径。 RNAi的发现是生物界的一场革命，siRNA技术是以转录后调节为目 的的新型基因调控技术，通过合成特异性小分子RNA抑制靶基因的表达， 已作为基因功能研究和基因治疗的全新手段。 本研究中，我们首先在体外观察上调或下调PAI．1表达对成纤维细胞 增殖的影响，然后应用PAI．1 siRNA治疗博来霉素诱导的肺纤维化，以期 为临床肺纤维化的治疗提供新的分子靶点。 方法： 1建立大鼠成纤维细胞低表达及过表达PAl。1的细胞模型 1．1体外分离培养原代大鼠胚肺成纤维细胞，免疫组化法检测波形蛋白及 Ct．SMA进行鉴定。 1．2筛选PAI．1 siRNA有效序列 参考文献，合成针对PAI．1 mRNA的3对siRNA序列，分别为 219siRNA片段，559siRNA片段和1061siRNA片段。应用脂质体法瞬时 转染成纤维细胞，以非特异性(NC)siRNA为阴性对照，采用Real time 中文摘要RT-PCR 中文摘要 RT-PCR及Western blot法从基因水平及蛋白水平分别检测三对siRNA分 子的沉默效率，筛选出针对PAl．1 mRNA高效的siRNA片段。 1．3为了应用含PAl—l基因的真核表达质粒PCDNA．PAl．1转染成纤维细 胞，载体PCDNA3．1作为阴性对照，Real time RT-PCR法观察24小时PAl．1 mRNA的表达，Western blot法观察48、72小时PAl．1蛋白的表达。 2 PAl．1对成纤维细胞增殖、转化、胶原合成、Ca2+浓度的影响及其机制 细胞分为Normal组、NC组、559 siRNA组、PCDNA3．1组、 PCDNA．PAl．1组，MTT法检测细胞24小时，48小时，72小时增殖效果； 激光共聚焦显微镜观察48、72小时细胞内游离Ca2+浓度的变化：细胞分 为Normal组、NC组、559 siRNA组以及Normal组、PCDNA3．1组、 PCDNA．PAl．1组，Real time RT-PCR法分别测定24小时Q。SMA、I型胶 原、III型胶原mRNA的表达；Western blot法分别测定48、72小时ERK、 p-ERK、AKT、p-AKT的表达。 3 559 siRNA对BLM诱导大鼠肺纤维化的治疗作用及其信号通路 130．140克Wistar健康雄性大鼠72只，分成4组，Sham组、BLM(B) 组、BLM+559 siRNA组(B+P组)和BLM+非特异(NC)siRNA组(B+N 组)。首先按5mg／kg气管内注入BLM制作肺纤维化模型，Sham组注入 O．2 mL生理盐水。造模后，每周两次气管内给药：B+P组注入DEPC水 溶解的559 siI矾A7．5nmol(O．2mL)；B+N组注入相同剂量的NC siRNA； Sham组和B组注入0．2ml生理盐水。于第7、14、28天各组分别处死6 只：Real time RT-PCR及Western blot法测定每个时间点PAl．1基因水平 及蛋白水平的敲除效率：观察治疗后组织学(脏染色)变化；Real time RT-PCR、Western blot及免疫组化法测定Q．SMA表达的变化；通过Masson 染色及羟脯氨酸含量的测定观察559 siRNA对胶原产生的影响，Real time RT-PCR及免疫组化法进一步分析I型胶原、III型胶原的表达，了解559 siRNA对不同胶原类型的影响；Western blot法测定不同时间点ERK、 P．ERK、AKT、P．AKT的表达，了解