pcr发明、原理及应用.pptVIP

PCR的发明、原理及应用 * PCR的发明 Kary B. Mullis ，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法 * DNA双螺旋结构于1953年发现 第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合酶于1956年分离成功 自1970年代起，由于发现选择性切割DNA分子的限制性内切酶及接合酶，可将DNA分子加以重组，因此引发了基因工程的开展 * 1983年春，Mullis发展出PCR的概念； 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环； 1984年11月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是86年春天Mullis建议做的； 1988年，第一台PCR仪问世； 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。 * PCR的原理 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 1.模板DNA的变性：即在高温（93℃左右）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板； 2.模板DNA与引物的退火(复性)：在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3.引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的5’→3’方向延伸，合成DNA新链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 * PCR反应五要素： 即参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模板、和Mg2+。 * （一）Mg2+ :终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2+ 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq DNA聚合酶竟争Mg2+ ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。 Mg2+ 能影响反应的特异性和产率。  * （二）dNTP：dNTP具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为 10mmol/L， 各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。 （三）Taq DNA聚合酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为70～75℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。某种dNTP或Mg2+ 浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。 * （四）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。 模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。 （五）引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。 引物G C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。 * PCR常见问题 1、模板原因 ① 纯度：含有抑制物 ② 浓度：含量低or太高 * 2、引物原因 ①引物错误 ②引物设计不好 ③引物合成、纯化不好 * 3、PCR条件原因 ①退火温度 ②延伸时间 ③循环次数 * 4、非特异性扩增