活性芽孢杆菌的分离、鉴定.pptx

活性芽孢杆菌的分离、鉴定与育种;引言;实验目的;实验材料与仪器;实验流程;一、活性菌株的分离筛选;一、活性菌株的分离筛选;二、紫外诱变;二、紫外诱变;3.原始菌株及突变株产酶能力的测定及其产酶稳定性检测 （1）.标准曲线的制作(见下表) ①取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。②摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在540 nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。;(2)粗酶液淀粉酶活力测定 按以下顺序操作： 取20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号。取粗酶液1 ml于各只刻度试管中，于60℃水浴中预热5min柠檬酸淀粉缓冲液同时在60℃水中预热5min，→取柠檬酸淀粉缓冲液1ml加入具塞刻度试管中,于60℃水浴中保温30min→加入1.5 ml 3,5-二硝基水杨酸,沸水中5 min,迅速冷却,加蒸馏水定容至20 ml。③定容后,摇匀,用分光光度计测定OD540 nm值。在上述条件下以单位体积样品在30 min释放1 mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。 在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量按下列公式计算酶活力 酶活力测定公式： 淀粉酶活力=麦芽糖含量（mg）·淀粉酶原液总体积（mL）/所加淀粉质量 后培养：应让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细 胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。;三、高产菌株发酵条件优化;三、高产菌株发酵条件优化;三、高产菌株发酵条件优化;三、高产菌株发酵条件优化;三、高产菌株发酵条件优化;三、高产菌株发酵条件优化;四、活性菌株的鉴定;四、活性菌株的鉴定;四、活性菌株的鉴定;四、活性菌株的鉴定;四、活性菌株的鉴定;五、菌种保藏;二、附录 （一）、培养基的配制 1、淀粉培养基 蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000mL，琼脂 15~20g，121℃灭菌20min 2、牛肉膏蛋白胨培养基 蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，蒸馏水1000mL，琼脂15~20g，121℃灭菌20min，pH7.0~7.2 3、种子培养基 蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl1%，琼脂2%，可溶性淀粉0.25% 4、发酵培养基 玉米粉10g，淀粉15g，豆粉20g，酵母粉3g，KH2PO4 0.3g，ZnSO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，pH7.0 5、糖发酵培养基 蛋白胨水培养基1000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1.6g溴甲酚紫溶解到100mL乙醇中）1~2mL，pH7.6，另配20%糖溶液，蛋白胨水121℃灭菌20分，20%糖溶液112℃灭菌30 min，分别灭菌后再混合。 6、明胶培养基 牛肉膏蛋白胨液100mL，明胶12~18g，pH7.2~7.4，在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌溶化后调pH，121摄氏度灭菌30 min; 7、柠檬酸盐培养基 NH4H2PO41g，K2HPO41g，NaCl5g，MgSO40.2g，柠檬酸钠2g，琼脂15~20g，蒸馏水1000mL，1%溴香草酚蓝乙醇液10mL，将上述各成分加热溶解后，调pH6.8，然后加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤。制成后为黄绿色，分装试管，121摄氏度灭菌20 min后制成斜面。 8、醋酸铅培养基 pH7.4的牛肉膏蛋白胨琼脂100mL，硫代硫酸钠0.25g，10%醋酸铅水溶液1mL，将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基加热溶解，待冷却至60摄氏度加入硫代硫酸钠调pH7.2分装于三角瓶中，115摄氏度灭菌15 min。取出后待冷至55~60摄氏度，加入醋酸铅水溶液，混匀后倒入灭菌试管中。 9、吲哚培养基 蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH7.6，121摄氏度灭菌20 min 10、葡萄糖蛋白胨培养基（V.P.、M．R实验） 蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO4 2g，蒸馏水1000mL，将上述各成分溶于水中，调pH7.0~7.2，分装试管，112摄氏度灭菌30 min。 11、硝酸盐液体培养基 MgSO40.05%，K2HPO40.05%，KNO30.1%，蔗糖2%，NaCl0.05%，Ph7.2，115摄氏度高压蒸汽灭菌30 min。 ;12、酪素培养基 A液：Na2HPO4·7H2O 1.07g，干酪素4g，加适量蒸馏水，并加热溶解 B液：KH2PO4 0.36g，加水溶解 A、B液混合后，加入酪素水解液0.3mL，加琼脂20g最后用蒸馏水定容至1000mL。 酪素水解液的配制：1g酪蛋白溶于碱性缓冲液中，加入1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL加水至100mL，30摄氏度水解1h。用于配制培养基时其用量