玉米大斑病菌黑色素合成酶基因4hnr的克隆与功能研究-植物病理学专业论文.docx

摘要 为明确玉米大斑病菌中黑色素的生物合成途径及其与病原菌致病性间的关系，本论文对玉米大斑病菌黑色素生物合成酶之一的I，3，6，8．四羟基萘还原酶(4HNR)基因 进行了克隆、生物信息学分析和功能活性研究，初步明确了4HNR基因的结构特性及 其在玉米大斑病菌黑色素合成途径中的作用。根据已知植物病原真菌黑色素生物合成酶基因4HNR的核苷酸序列保守区域设 计特异性引物，分别以玉米大斑病菌基因组DNA和cDNA为模板，通过PCR扩增 获得了4HNR基因的同源片段，并利用Genomic walking技术得到了4HNR的DNA 全长序列。经过DNA序列和cDNA序列对比分析，发现该基因DNA和eDNA全长均为807 bp，没有内含子结构；含有一个完整的开放阅读框架，编码268个氨基酸残 基，蛋白的分子量约为28．484 kD，等电点pI 6．52；含有118个疏水性氨基酸残基和 150个亲水性氨基酸残基；包含1个完整的3．酮酰基．ACP还原酶活性区域。已经将 该基因序列登录到GenBank数据库，获得核苷酸序列登录号为：EU494943，蛋白序 列登录号为：ACA52027。利用NCBI中生物信息学软件分析其氨基酸序列与玉米小 斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)1，3，6，8．tetrahydroxynaphthalene reductase氨基酸 序列的同源性为96％，与粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)tetrahydroxynaphthalenereductase氨基酸序列的同源性为78％。制备基因特异探针进行Southern杂交分析，在用基因中不含酶切位点的限制性内 切酶进行酶切的产物中均出现1条阳性带，在用基因中含有单个酶切位点的限制性内 切酶进行酶切的产物中出现2条阳性带，该结果充分表明，4HNR基因在玉米大斑病 菌基因组中以单拷贝的形式存在。利用Genomic walking技术获得了4HNR基因5’端 2 285 bp、3’端301 bp的非编码区，使用国际上通用的启动子分析软件Sofeberry、NNPP对其进行启动子活性区域分析，结果发现，在起始密码子前1 000 bp左右范围内有很强的启动子活性结构，其中在一34处发现了1个TATA box，一70处发现1个CAAT box， 等等。利用毕赤酵母分泌质粒pPIC9K构建了4HNR基因的真核表达载体，电击法及 PEGl000介导法转化毕赤酵母菌株GSll5进行分泌表达，得到了重组的酵母菌株， 从蛋白图谱初步推测出，酵母菌株的上清液中分泌表达了少量目的蛋白。构建了 4HNR基因的双交换同源重组型基因敲除载体，利用PEG4000介导法转化玉米大斑 病菌的原生质体，共获得了31个潮霉素3代筛选后的阳性转化子，其中有一个菌株 呈现灰白色菌落，经PCR验证有清晰的潮霉素扩增条带，初步推测其为突变菌株。 本试验从基因克隆、基因表达和基因缺失突变体分析三个方面进行研究，为进一步明 确玉米大斑病菌的致病机理、研究基因水平上黑色素对附着胞机械穿透力的调节作用 提供理论依据，为新型杀真菌制剂的研制奠定了基础。关键词：玉米大斑病菌；黑色素：1，3，6，8-四羟基萘还原酶(绷)；功能研究Cloning and Functional Analysis of the Melanin Biosynthesis Gene 4HNRin Setosphaeria turcicaAuthor：Wen Lei．1ei Major：Plant Pathology Supervisor：DongJin-gaoAbstractIn order to identify也e melanin biosynthetic pathway and the relationship between melanin and the pathogenicity of Setosphaeria turcica，1,3，6，8-tetra-HN reductase(4HNR) which belong to the melanin biosynthetic pathway were cloned and the functional research were done by bioinformatics and mutants analysis，meanwhile analysis of gene expression was completed．It Was conclusion that 4HNR gene might play all important role in melanin biosynthetic pathway and pathogenicity ofS．tur