腺苷a3受体激活在大鼠实验性蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用及机制分析-外科学(神经外)专业论文.docx

腺苷 A3 受体激活在大鼠实验性蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用及机制研究摘要背景和目的蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是一类临床常见的脑血管危急重 症，具有死亡率高、致残率高、发病多见于中青年的特点，严重威胁人类健康和生命。 近年来的研究认为蛛网膜下腔出血后继发的早期脑损伤(Early brain injury，EBI)可能是 SAH 后早期致死致残的主要原因。研究如何减轻 SAH 后继发早期脑损伤对提高蛛网 膜下腔出血患者的生存率及改善预后具有重要的意义。早期脑损伤是最近几年提出来的一个新概念，指从动脉瘤破裂出血那一刻到血管 痉挛发生前这一约 72h 时间窗的整体性的脑损伤，是从整体的角度来看待蛛网膜下腔 出血后脑内发生的一系列病理损伤，其确切机制尚不完全明确，目前研究认为 EBI 可 能是多因素、多途径的病理过程。大量研究表明炎症反应在 SAH 后早期脑损伤的形成 中起着重要的作用。干预或减轻蛛网膜下腔出血后脑组织炎性损伤可能是减轻早期脑 损伤，降低死亡率的一条新策略。腺苷(adenosine,ADO)是内生性三磷酸腺苷(ATP)的代谢产物，通过其四种受体蛋 白(A1、A2A、A2B、A3 receptors)参与多种致病因素引起的疾病过程。近年来腺苷 A3 受体亚型的抗炎特性越来越受到研究者的重视。研究表明，腺苷 A3 受体活化在类风 湿性关节炎、肺炎、心肌梗塞等病理条件下能够减轻炎症反应从而对机体发挥保护作 用。更有大量体外研究观察到腺苷 A3 受体参与小胶质细胞、中性粒细胞、T 细胞、 星形胶质细胞等免疫炎性细胞活化的调控，调控多种炎症介质的释放。研究证实 A3 受体在原代培养的小胶质细胞、BV2 及 N9 小胶质细胞株等小胶质细胞上均有表达， 腺苷对 LPS 诱导的小胶质细胞的炎症因子释放的抑制，可能通过激活 A3 受体发挥抗 炎作用。由此我们假设，激活腺苷 A3 受体可能通过抑制小胶质细胞活化，减轻 IL-1β、 IL-6、TNF-α 等炎症介质的释放，减轻炎症介质对神经元直接毒性损伤和血脑屏障通 透性损害，从而减轻早期脑损伤的脑水肿程度，发挥对 SAH 后早期脑损伤的神经保护 作用。为了验证上述假设，本研究分三部分进行，第一部分采用颈内动脉线栓刺破法建立大鼠实验性蛛网膜下腔出血模型，观察予以腺苷 A3 受体特异性激动剂 Cl-IB-MECA干预后对大鼠死亡率、神经功能损伤及脑组织含水量、血脑屏障通透性损害的影响， 并通过尼氏染色、TUNEL 检测其对神经细胞损伤的影响，以明确激活腺苷 A3 受体是 否对 SAH 后早期脑损伤具有保护作用；第二部分则通过荧光定量 RT-PCR、ELISA 检 测了腺苷 A3 受体激活后 SAH 大鼠脑组织内主要炎症因子的转录和表达释放，免疫荧 光组织化学法观察脑组织皮层及海马区域主要炎症细胞小胶质细胞和星形胶质细胞活 化的情况，以观察激活腺苷 A3 受体是否可以减轻 SAH 后脑组织炎性损伤，同时为了 进一步确定其对炎性反应的影响是直接的干预作用还是通过对神经细胞本身的保护，而 导致的炎症反应伴随性减轻，我们采用二氯化钴诱导建立的 PC12 神经元样细胞化学缺 氧损伤模型，观察腺苷 A3 受体激活对神经细胞本身是否有直接的保护作用；第三部分 通过脂多糖 LPS 诱导 BV2 小胶质细胞活化模型模拟 SAH 后小胶质细胞活化的体外模 型，通过体外实验，采用流式细胞术、ELISA、激光共聚焦、western blot 等方法观察腺 苷 A3 受体激活对小胶质细胞活化的表面标志物 CD11b 表达、炎性细胞因子释放、相关 信号通路的影响三个方面来进一步证实腺苷 A3 受体对小胶质细胞活化的抑制作用及其 分子机制。材料和方法整个研究包括在体和离体实验。在体实验建立了 SD 大鼠蛛网膜下腔出血脑损伤模 型，并观察腺苷 A3 受体特异性激动剂对 SAH 后早期脑损伤的神经保护作用及脑组织 炎症反应水平的影响；离体实验以大鼠嗜铬细胞瘤细胞系 PC12 模拟神经元，培养 BV2 小胶质细胞，并观察腺苷 A3 受体激活通过抑制小胶质细胞活化，发挥神经保护作用的 效应及具体机制。1. 应用颈内动脉线栓穿刺法建立 SD 大鼠 SAH 模型；2. 将 SD 大鼠分为 Sham( 假手术组 ) ， SAH( 蛛网膜下腔出血组 ) ，以及 Cl-IB-MECA(腺苷 A3 受体特异性激动剂 CL-IB-MECA 干预组)三组，分别测定大鼠脑 组织含水量、血脑屏障通透性以及死亡率；3. 应用 Garcina 评分及前肢放置试验检测 Sham、SAH 及 Cl-IB-MECA 三组大鼠 的神经行为功能；通过尼氏染色、TUNEL 检测明确其对神经细胞损伤的影响4. E