人ipscs诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究-眼科学专业论文.docxVIP

人 iPSCs 诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究 中文摘要 第一部分： iPSCs条件培养基促进 B-CECs生长的研究 目的：评估 iPSCs 条件培养液(iPSCs-derived conditioned medium, iPSCs-CM)对 B-CECs 生 长的作用。方法：利用 0.22μm 的过滤器滤过后-80℃冷冻储存的方法收集已经使用过的 iPSCs 培养基， 按一定比例添加收集的培养基到普通内皮细胞培养基(corneal endothelial medium, CEM)中 培养 B-CECs 即为实验组，未添加的为对照组。通过 CCK-8，流式细胞仪检测细胞周期、 细胞凋亡情况，活细胞计数及 Western blot 对磷酸化的 Akt 蛋白表达量的检测验证条件培 养基对于角膜内皮细胞增殖活性的影响；通过 PCR，免疫荧光染色，划痕实验，荧光素钠 渗透实验（fluorescein leakage test, FLT）探讨条件培养基对角膜内皮细胞标志蛋白基因表 达的影响及对内皮细胞功能的影响；最后通过 ELISA 对条件培养基有效成分进行分析。结果：25%iPSCs-CM 是培养 B-CECs 的最佳浓度。细胞培养到第 4 代实验组形态仍维持均 一六角形，而对照组内皮细胞不规则增大失去六边形结构。免疫荧光染色示 B-CECs 在 iPSCs-CM 和 CEM 中均可表达 ZO-1, Na+/K+-ATPase。定量分析 Ki67, Na+/K+-ATPase, Col4A, Col8A 基因表达，实验组细胞较对照组细胞基因表达量明显上调(P0.05, n=3)。同 时，细胞周期检测示，进入 S 期和 G2 期细胞比率实验组较对照组高，用流式细胞仪检测 培养 4 代的 B-CECs 凋亡细胞较对照组少，差异有统计学意义(P0.05, n=3)。在划痕实验 及荧光素钠渗透实验中，同对照组比较，实验组细胞移行效率更高且在传 4 代过后具有更 好的屏障功能。机理分析发现，经饥饿处理后的细胞，在添加实验组培养基后磷酸化的 Akt 持续高表达到 180min，而对照组表达量则逐渐减少。这一发现表明，iPSCs-CM 可能通过 上调 PI 3-kinase 信号通路调节细胞周期，是 iPSCs-CM 促进 B-CECs 细胞增殖的机制之一。 条件培养液有效成分分析发现，Actvin A 表达量在实验组明显升高，培养基添加 Actvin A 后，可使 B-CEC 细胞形态维持跟条件培养基相类似的六边形形态。结论：iPSCs-CM可有效促进B-CECs增殖同时保持内皮细胞的功能，Actvin A是其促进细胞 增殖、维持细胞形态的有效成分之一，其促增殖的机理与磷酸化的Akt持续高表达有关。I第二部分： transwell 接触共培养促进 单散 iPSCs 细胞 生长及分化 目的：观察transwell接触共培养促进单散细胞人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)生长及分化的作用。方法：将1-2代牛角膜内皮细胞(bovine corneal endothelial cells, B-CECs)接种在transwell小室 底面培养8h后，应用ACCUTASE酶消化及40μm过滤处理获得iPSCs单散细胞，将其接种到 已有CECs的transwell小室内共培养14d，前3d使用mTeSR1培养基，第4d开始用含10%胎牛 血清的低糖DMEM培养基。分别进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)、免 疫荧光、死活细胞染色及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)染色，对iPSCs多能特性表达 及分化进行鉴定。设定iPSCs单散细胞共培养组为实验组，常规培养iPSCs组为对照组一， 非共培养iPSCs单散细胞组为对照组二。结果：培养B-CECs形态呈典型的六边形铺路石样外观，人iPSCs呈克隆样生长，共培养3d 后iPSCs贴壁呈单散细胞生长，免疫荧光检测未分化标志Nanog和Oct4呈阳性，qPCR检测 Nanog、Oct4、Sox2基因表达实验组与对照组一比较差异无统计学意义(P0.05, n=3)。死活 细胞染色实验组死细胞明显减少，与对照组二比较差异有统计学意义(P0.001, n=3)。共培 养14d后，人iPSCs细胞形态比较均一，呈多边形，体积增大，无明显克隆团块。AP染色阴 性，免疫荧光染色CD31表达阳性，CD34和CD133表达阴性。结论：与 B-CECs 共培养可增强人单散细胞 iPSCs 活性，使 iPSCs 形态上向内皮样细胞转 化，表达部分角膜内皮细胞标志。transwell 接触共培养