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目的基因的获取 化学合成法 cDNA文库 基因组DNA文库 聚合酶链式反应 * 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 * 较短的核酸片段（60-80bp） 用途：PCR引物 测序引物 定点突变 核酸杂交探针 * PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大 染色体 PCR 基因放大连琐反应 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) * mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 * 尿素-氯化锂法 硫氰酸胍法 polyT亲和层析法 密度梯度离心分级法 探针筛选法 （一）mRNA的提取与纯化 * 胍类化合物 尿素 氯化锂 Rnasin---RNA酶 DEPC 尿素-氯化锂法、硫氰酸胍法 * polyT亲和层析法 AAA AAA AAA AAA polyT polyT polyT * * （二）从mRNA制备cDNA 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 * 周俊宜 fzyxzjy@126.com * 目的基因 研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量DNA和蛋白质分子,首先都要把它从庞大的基因组中分离出来。 你所感兴趣和想研究的基因，称为目的基因。 * * 克隆 来自同一始祖的相同拷贝的集合。 分子克隆 细胞克隆 动物克隆 * DNA克隆 目的基因 载体 复制子 宿主细胞 扩增 扩增 提取DNA分子 * 畜產系 鄭登貴 教授 抗虫基因转殖烟草 荧光基因转殖鱼 抗老化转殖兰花 基因转殖羊 * * * 基因工程 * 挑出所要群落 得到纯系转殖菌株 大量培养生产 人类胰岛素 Human Insulin 探针 Probe 互补 DNA 专一性抗体 送入宿主细菌 基因接入载体 目标基因剪接 Stryer (1995) Biochemistry, p. 119 Kleismith Kish (1995) Cell and Molecular Biology, p. 115 * 生物大分子的定量概念 基因的大小 分子质量（ku） 碱基对数目（bp） 质量单位（?g、ng、pg） 摩尔单位（pmol） 光密度单位 * 基因大小可用分子量或碱基对（basepairs， bp）表示。 化学物质的分子量单位是道尔顿（Darton，D）即原子质量单位u（1u=1.6605402×10-27 kg）。 生物大分子则以D或U单位的千（kilo-）或百万（mega-）倍来表示，写成kD（Ku）或MD（Mu）。 构成DNA的脱氧单核苷酸（dNMP）有dAMP、dGMP、dCMP和dTMP4种，其平均分子量为0.34kD（340D）。 生物体DNA是双链结构，故常用bp，千碱基对（kb）或百万碱基对（Mbp）表示其大小。1bp=0.68kD. * 1kb=680kD=0.68MD 1MD=1.47kb或1kD=1.47bp DNA 1kb≈120×330≈蛋白质40kD 蛋白质1kD≈DNA 250bp * 分子量1MD的双链DNA：1μg=1 pmol 分子大小1kb的双链DNA：1μg=0.68 pmol 或: 1pmo=1.47μg 一个O.D260单位的核酸溶液,浓度随核酸种类而定： DNA=50μg/ml 单链DNA=33μg/ml RNA=40μg/ml * 基因组的大小 细胞或生物体中一套完整单体的遗传物质的总和。 人类基因组包含22条常染色体和X、Y 两条性染色体和线粒体上的全部遗传物质。 不同生物的基因组大小复杂程度不同，其大小一般与进化程度相关。 * * 染色体chromosome * 几种生物的基因组比较 病毒SV40 5.2 1 环状 大肠杆菌 4000 1 环状 酵母 17000 17 线状 人 5-7×106 23 线状 种类 大小 （ Kb） 染色体数 形状 * * * 大肠杆菌基因图 大肠杆菌的细胞核无核膜和核仁，没有固定的形态，结构简单，称为拟核，也称细菌染色体。 拟核具有高度紧密的结构，由RNA、蛋白质和超螺旋环状DNA组成。 环