中国医科大学《免疫学》第二十五章 免疫学技术.pptVIP

生物素-亲和素技术 亲和素-生物素-过氧化物酶技术（ABC法） 桥联亲和素-生物素技术（BRAB技术） 标记亲和素-生物素技术（LAB） 葡萄球菌A蛋白技术：SPA和IgG的Fc段 凝集素法：识别表位和荧光素、酶等 链霉亲和素-生物素技术：类似亲和素 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。 免疫金染色法（IGS）：不用染色就能检测细胞表面的抗原，又能检测细胞内抗原。 免疫金银染色法（IGSS）：利用银显影液，胶体金颗粒起着液化作用，使显影液中的银离子(Ag+)在还原剂存在的情况下被还原成银原子。 彩色免疫金银法（CIGSS）：在IGSS基础上发展起来的一种新方法。其基本原理是抗原位点处生成的银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的作用被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂相接触即被还原成金属银；而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色还原剂由无色变成有色的染料并沉积在银颗粒部位。 将抗体分子标记上胶体铁，通过普鲁蓝反应呈色。 免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。 胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合。 目前使用的早早孕诊断试纸条利用的就是胶体金免疫层析法。 本节重点： 免疫标记技术的特点和类型 放射免疫分析技术的概念 ELISA的概念，原理和种类 免疫胶体金技术原理 * 免疫学教研室 张学星 用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记的抗体(或抗原)进行抗原抗体反应，标记物与抗体(或抗原)的化学联结未改变抗体(或抗原)的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，使检测灵敏度大大提高，可以对微量物质进行定性、定量或定位检测。 分类 同位素标记技术 免疫荧光技术 免疫酶技术 类别 标记物 用途 荧光素 FITC、RB200、TRITC 、镧系元素螯合物 免疫组化 免疫分析测定 放射性核素 3H、14C、32P、57Gr、 125I、131I 免疫分析测定 酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定 化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定 金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定 将抗原抗体反应的特异性与同位素测定技术的敏感性相结合的一项新技术。具有特异性强、灵敏度高、准确性和精密度好等优点，而且操作简便、易于标准化，其灵敏度可达109～1012g水平。 利用标记抗原和待检抗原竞争结合原理，先按一定量标记抗原 (Ag*)和待测抗原 (Ag)混合，然后加入抗血清 (Ab)，孵育一定时间，使反应达到平衡，即形成结合型的标记抗原Ag*-Ab(B)和游离型标记抗原Ag*(F)。 RIA常用的同位素是8H和125I和3H。3H标记需要在特殊装置中进行，因其半衰期很长，故多由放化试剂中心标记后做成试剂盒供应。125I半衰期60天，可用氯胺T法将其连接于酪胺残基的芳香环上，形成碘化结合物。本法主要用于激素等活性物质的超微量分析，常用的有液相法和固相法2种。 免疫酶技术就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种检测技术。 分类 免疫细胞组织化学技术 酶标抗体法：直接法、间接法 非标记抗体酶法：酶桥法、 PAP法 酶免疫测定技术 均相酶免疫测定 异相酶免疫测定：液相酶免疫测定、固相酶免疫测定(ELISA) 免疫细胞组织化学技术：用酶标记已知抗体（或抗原），与组织标本在一定条件下反应，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应。 酶标抗体法：借助交联剂的共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体。酶标抗体与靶抗原反应后，再通过对底物的特异性催化作用生成不溶性有色产物。 直接法： 间接法： 用于标记的酶有辣根过氧化物酶 （HRP）、碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶、酸性磷酸酶和B-半乳糖苷酶等。其中以HRP应用最广。 HRP的作用底物为过氧化氢，催化时需要供氢体，无色的供氢体氧化后生成有色产物，从而使不可见的抗原抗体反应转化为可见的呈色反应。 非标记抗体酶法：用酶免疫动物制备抗酶抗体，再将酶与抗酶抗体结合形成复合物，通过酶的底物显色达到对抗原进行检测。 酶桥法： PAP法： 酶免疫测定技术 均相酶免疫测定：利用酶标记物结合成抗原抗体复合物后，标记酶的活性就受到抑制，因而反应后不需分离结合的和游离的酶标记物，直接测定系统中的总标记酶的