中国医科大学《免疫学》实验三 血清抗体的检测.pptVIP

检测小鼠抗绵羊红细胞抗体水平 酶联免疫吸附试验技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA） 妊娠试验－检测尿液HCG 胶体金免疫层析技术 1、稀释血清 10倍稀释 1.5ml EP管 2个；标记 450ulPBS+50ul血清 或270ulPBS+30ul血清 10倍稀释血清，按下表加于孔中，每孔100μl SRBC PBS SRBC PBS + + － － T 致敏T细胞 抗体 B 浆细胞 Y Y Y Y Y Y Y SRBC—Ag Y 待测血清－Ab 酶标二抗 底物 产物 绵羊红细胞（SRBC） 碳酸盐缓冲液（pH9.6） 封闭液（5% BSA/PBS 溶液） 洗涤液（PBS+Tween，pH7.4） 抗SRBC阳性和阴性血清 磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4） 辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠抗体 底物缓冲液 邻苯二胺，H2O2 硫酸（2mol/L） 酶标反应板、微量加样器、Ep管、滤纸 温箱、冰箱、酶标仪等 1、ELISA试剂与材料 2、ELISA:操作步骤 包被抗原 → （于实验一完成！） SRBC冻融稀释 每孔100μl, 37℃ 2小时 洗板3次，弃上清，加封闭液，每孔200μl 37℃，1小时 弃去孔中液体，洗板3次 10倍稀释血清，按下表加于孔中，每孔100μl 37℃，50min 弃去孔中液体，洗板3次，每次1min SRBC PBS SRBC PBS + + － － 加一抗 → 37℃，50min 弃去孔中液体，洗板7-8次 加入底物液，每孔100μl 避光5-8min 每孔加入终止液50μl 加入HRP标记抗体，每孔100μl 加二抗 → 加底物 → 3.1目测 无色（-） 浅色（+） 黄色（+ +） 棕黄色（+ + +） ++以上者为阳性 3、ELISA结果分析 3.2酶标仪测定OD492 Cut off值：COV=阴性对照平均值×2.1 OD≥COV为阳性 ODCOV为阴性 定量测定 参考标准品制作标准曲线 待测样品OD值 封闭液加满反应孔 去除孔壁气泡 洗涤液加满，但不要溢出 加不同样品时更换枪头 洗涤液停留时间不应少于1分钟 洗涤时不要残留液体 加终止液后10分钟内测量OD值 4、注意事项 人绒毛膜促性腺激素（HCG）在尿液中的检测 妊娠3～8周达到高峰 本实验的试纸条用胶体金标记的抗HCG单克隆抗体、抗HCG抗体、抗鼠IgG抗体分别与固相硝酸纤维膜依次粘帖制成。 妊娠检测试验 尿液在毛细效应下向上层析 阳性：测试区（T）显色 阴性：测试区（T）不显色 控制区（C）显色 1、试验原理 每两人一组，使用一条试纸 任选尿样1或尿样2，将有箭头标志的一端垂直浸入装有尿液的容器中，勿超过纸条上的MAX线 3秒钟后取出平放于干净的非吸附材料的平面 5分钟观察紫红色条带的出现 2、试验方法 阴性：只有C显色，没有怀孕 阳性：T，C都显色，怀孕 无效：C不显色，表明试验失败或试剂失效 3、结果判定 仅供一次性体外诊断使用 超过有效期后请勿使用 试条密封干燥保存 打开密封包装后应尽快使用 浸入样品时勿超过纸条上的MAX线 应在规定的时间判断结果 怀孕早期可能有假阴性结果，可在48～72小时后重新收集晨尿再次测定 某些肿瘤患者可能会出现假阳性结果，应结合临床表现判定 4、注意事项