PCR疑难解答.doc

PCR疑难解答 当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：将PCR反应的试管与反应板紧贴。当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。没有扩增产物：在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。检查模板和引物的用量。增加循环次数和/或模板DNA的用量。泳道中出现模糊条带：减少循环次数或模板DNA的用量。提高退火温度，但不要超过68℃。重新设计引物或设计更长的引物。其他值得注意的条件：建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。建议使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。延伸：68--72℃下进行延伸操作。循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。引物设计：一般长度20-30bp；至少50%的GC含量；避免引物二聚体和二级结构；引物对的Tm值应该接近。也可下列图示提示找到解决问题的突破口：  9、PCR扩增过程中若干影响因素？ 引物：在Tris缓冲液中，引物可以低温保存相当长的时间。除非有核酸酶的污染，引物一般非常稳定。笔者使用过10年前的引物，仍然好用。问题的关键在于您的引物设计是否合理，使用过程是否规范。如果您怀疑引物有问题，可以选择重合。如果重合后，还没有改善，请查其他原因。引物到用户手头前都是以干粉形式存在的，干粉很容易丢掉，引物溶解后可以测定一下OD，将所有引物的浓度调整到一致，对实验有一定帮助。 高温聚合酶：高温聚合酶是非常稳定的，除非有蛋白酶的污染。但是不同公司提供的酶扩增是有差异的，活性定量和标示未必相同。选用表现一贯稳定的酶，而不是最便宜的。当然，便宜又好最好，哪里有？我们这里啊！ dNTP: dNTP是PCR扩增体系中最不稳定的，反复冻融会使dNTP发生降解。dNTP是由dATP,dCTP,dGTP,dTTP等摩尔组成，但是他们的稳定性不同，发生降解的程度不同，导致4种dNTP的浓度不一致，即使不发生降解，4种 dNTP如果浓度不等，PCR效率和正确率都会受到影响。建议分装小包装，减少反复动容冻融的次数。 缓冲液：缓冲液一般不容易出问题，只是使用前需要彻底融化混匀使用。如果您PCR不熟悉，使用含Mg的缓冲液。缓冲液中可以加入适量的甘油、DMSO等增强剂，目的是改善高GC含量等疑难模板的扩增。 Mg2+:是TAQ活性所必须的，浓度过高过低对反应