肿瘤生物治疗实验室常用实验方法-2007.docVIP

肿瘤生物治疗实验室大肠杆菌质粒DNA的提取碱裂解法此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。 取1.5ml细菌培养物于EP管中，000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥； 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100 l溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，振荡； 加入200 l新配制的溶液II (0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中； 加入150 l预冷溶液III (每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟； 在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管； 用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转速离心5分钟； 小心上清，乙醇沉淀用12,000g离心2分钟，弃上清H2O溶解。 加入0.5μl的RNase （10mg/ml）37℃温育5~10分钟；电泳鉴定。l，10000g离心1min； 2.弃上清，加入20~50μldd H2O重悬菌体； 3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀； 4.10000g离心3~5min； 5.小心取出上清即可用于电泳鉴定或转化。 2．琼脂糖核酸电泳用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子； 根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30 ml）； 放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固； 室温下3045分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内； 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去； 在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内； 接通电源，红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可； 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳； 电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度 线形DNA的最佳分辨范围（bp） 0.5% 1,000～30,000 0.7% 800～12,000 1.0% 500～10,000 1.2% 400～7,000 1.5% 200～3,000 2.0% 50～2,000 乙醇沉淀DNA加入1/10体积的乙酸钠（3 mol∕L，PH5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3 mol∕L； 加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃15~30分钟； 12,000 g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴； 加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴； 于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干； 加适量的溶解DNA沉淀。 胶回收纯化DNA琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量； 按照每100mg加400μl的量加入binding buffer，放入到EP管振荡器中，45℃～55℃温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5分钟）； 取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm 离心1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中； 加500μl的wash buffer至柱中，8,000rpm 离心1分钟。弃管中的溶液； 重复操作4步的操作1次，最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒，除去痕量的wash buffer； 将纯化柱放入一个新的EP。加30~40μl H2O或者elution buffer至纯化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。 注：若想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按10μl液量加400μl的binding buffer,其余的步骤不变。酶 切酶切前确定待切样品的浓度选择合适的内切酶和配套Buffer。 在离心管