重组体在真核细胞中表达.pptVIP

重组体在真核细胞中表达 一、重组体在真核细中表达的策略 1、哺乳动物细胞表达的优点及载体种类 1） 真核细胞表达体系的优点： 重组DNA在原核细胞中的表达仍是最常见的表达方式，但要想获得具有生物活性的真核蛋白质，必须在真核细胞中进行。 有活性的蛋白质不仅要转录和翻译，还要进行翻译后的加工，还要使得蛋白质的空间折叠方式维持正常，使得表达的蛋白质具有生物活性。 哺乳动物细胞能够识别和去除基因中的内含子； 对翻译后的蛋白质可进行加工。 哺乳动物细胞易被重组的DNA转染，又可将表达的蛋白质产物分泌到培养基中； 转化的真核细胞还可进行转基因的细胞移植，对人类的遗传性或非遗传性疾病进行基因治疗。 某些宿主细胞存在可以识别病毒的受体，从而使外源基因可以被高效地导入宿主细胞。此外还可利用病毒的外壳蛋白质包装重组的DNA，形成假病毒颗粒(pseudo-virion)以提高外源基因导人宿主细胞的效率。 2）目前常用的可将外源基因导入真核细胞的载体除了细菌质粒外，还有动物病毒表达载体。 病毒载体 病毒载体可以经过一定的改造后，成为基因转移和表达的分子载体。 病毒载体具有真核细胞可以识别的启动子，能够使外源基因或报告基因得到表达。 有些基因可以插入到病毒基因组中，随着病毒复制，拷贝数大量增加。也有些基因可以在病毒复制过程中，插入到宿主基因组中，可以进行稳定表达。 病毒载体可分为两大类，即整合型(integrated)和游离型(transient) 整合型载体： 可将外源基因整合到宿主细胞的基因组，外源基因随着宿主细胞的基因组复制而得到扩增，如反转录病毒载体、SV40病毒载体。 游离型载体： 以完整或缺损病毒的形式携带外源基因，不整合到染色体上，以病毒颗粒的形式在宿主细胞内自我复制或在辅助病毒存在下进行复制，如痘苗病毒、腺病毒载体等。 （一） SV40载体 猿猴空泡病毒40 (simian vacuolating virus 40，SV40)为多瘤病毒属病毒，SV40病毒的基因组是一种双链共价闭合环状DNA，是第一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒DNA，它含有5243个碱基对，其酶切图谱及各种功能基因的定位均已清楚； 基因组分早期和晚期两个功能区，共编码5种蛋白质； 早期基因区编码T和t抗原，T抗原的功能是控制SV40基因组的复制； 晚期基因区编码VPl、VP2和VP3三种外壳蛋白质； SV40病毒感染不同的宿主细胞，可产生不同的效应。 感染许可性细胞(permissive cell)时形成裂解性感染。猿猴细胞是病毒的许可性细胞。 裂解性感染：病毒感染细胞后，在细胞内大量复制，产生新的病毒颗粒，最终导致宿主细胞死亡。 病毒的非许可性细胞(non-permissive cell)： 不产生感染性颗粒，而是将病毒基因组整合到宿主细胞的染色体上，使细胞被转化，如啮齿动物仓鼠、小鼠的细胞。 病毒的半许可性细胞(semi-permissive cell)： 很少产生感染性的病毒颗粒，病毒基因组DNA也极少整合到细胞基因组而使细胞发生转化，如人体细胞是SV40病毒的半许可性细胞。 SV40病毒为基础的载体构建类型： 1） 取代型载体 2） 重组的病毒-质粒载体 取代型的重组病毒载体： 构建载体时可去掉一段晚期区DNA，而后用外源基因进行替代插入。 这类病毒需用辅助病毒进行感染。 若在早期功能区插人外源基因，由于早期区功能与病毒的致癌性有关，这样的载体在应用上存在着一定的危险性。 重组的病毒-质粒载体： 这种载体中保留了病毒基因组中维持在哺乳动物细胞中进行复制所需的相关序列，同时与细菌质粒融合，不会形成感染性病毒，因此这种载体能在大肠杆菌细胞中进行复制和增殖，是一种类似于质粒的DNA分子载体。 缺点： ①感染的宿主范围有限，只能在猿猴细胞中复制，而且随着病毒的繁殖，细胞裂解死亡，对于研究基因的表达与调控是不利的； 缺点： ①感染的宿主范围有限，只能在猿猴细胞中复制，而且随着病毒的繁殖，细胞裂解死亡，对于研究基因的表达与调控是不利的； ②载体DNA分子量小，可插入的外源基因DNA容量小； ③用辅助病毒进行混合感染时，有可能产生野生型SV40，从而带有一定的危险。 (二)痘苗病毒载体 痘苗病毒是一种双链DNA病毒，基因组DNA的分子量可达180kb，可编码200种左右的蛋白质分子，这些蛋白质分子包括痘苗病毒自身复制和基因转录所需的多种特殊的酶类，因此痘苗病毒可不依赖宿主细胞，独立地在细胞质中而不在细胞核中进行复制和转录，故无致癌性。 优越性： 宿主范围广泛， 可插入的外源基因的最大片段可达25kb， 外源基因插入后并不影响病毒的复制和表达，一般作为外源基因瞬时表达的载体。 缺点： 1. 基因组DNA分子量较大，达180kb, 因