生物化学--实验三血清总蛋白的测定.doc

实验三 血清总蛋白的测定【目的要求】 1.双缩脲法测定蛋白质的原理。 2【实验原理】 两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与Cu2+双缩脲反应 []，生成紫红色。 蛋白质肽键（-CO-NH-），碱性与Cu2+[B]，生成的紫红色络合物在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在范围内关系 据此，对已知系列浓度的蛋白标准液（S1~S5）做双缩脲反应，用其浓度作横坐标，吸光度为纵坐标，即可绘出一条过原点的蛋白质双缩脲反应剂量曲线。通过此曲线，便可查出测定管的。标本中的总蛋白1.试管及试管架2.0.2ml微量吸管或200μl微量加液器3.1ml、2ml、5ml刻度吸管4.721型分光光度计二、试剂 .6mol/L NaOH溶液 称取AR级NaOH 240.0g，溶于约800ml新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，冷却后稀释至1OOO.0ml，贮存于有盖塑料瓶中。若用非新开瓶的NaOH，须先配成饱和溶液，静置2周左右，使碳酸盐沉淀，其上清饱和NaOH溶液经滴定后，算出准确的浓度再使用。 .双缩脲试剂 称取AR级的结晶硫酸铜（CuSO4·5H2O ）3.0g，溶于新鲜制备的蒸馏水（或刚煮沸冷却的去离子水）500ml中，加入AR级酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）9.0g用以结合Cu2+防止CuO在碱性条件下沉淀KI 5.0g，防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu2O的离析待完全溶解后，在搅拌下加入6mol/L NaOH溶液100ml，再加蒸馏水稀释至1000ml，混匀，置塑料瓶中盖紧保存温下可半年若贮存瓶中发现有黑色沉淀，则需要重新配置。.1%蛋白标准液 ⑴可用当地质控中心提供的标准血清配制，如取定值为75g/L之标准血清1.0ml，用生理盐水准确稀释至7.5ml即成；⑵也可用市售冻干牛血清白蛋白【实验操作】 取CC干净试管支，按所示进行。’) S1 (S1,1’, 1’’) S2 (S2,2’,2’’) S3 (S3,3’,3’’) S4 (S4,4’,4’’) S5 (S5,5’,5’’) U1 (U1, 1’) U2 (U2, 2’) ⑴血清 0.5 0.5 ⑵1%蛋白质溶液 — 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 — — ⑶0.9% NaCl溶液 0.5 0.4 0.3 O.2 0.1 — — — ⑷双缩脲试剂 2.比色 混匀各管置370 min，之后用721分光光度计，波长540nm光径1cm，以调零，吸光度各管⑴查图：利用测定管的平均吸光度 AU1、AU2，在所绘的剂量反应曲线上查出总蛋白浓度X1和X2，最后算出标本的平均总蛋白浓度（X）。 ⑵计算：按下列公式计算 将AU1、AU2，分别代入AU，将任一标准管，如S3的吸光度代入AS，再乘S3的蛋白质浓度【】【】双缩脲法测定血清总蛋白 管 别 加入(ml) B (空白管) S (标准管) U (测定管) 1.血清0.50 — — 0.50 2.标准— — 0.50 — 3. 0.9% NaCl溶液 — 0.50 — — 4.双缩脲— — — 5.双缩脲试剂 .0 4.0 4.0 * 双缩脲混匀各管，置℃30 min或37℃水浴10 min，之后用721分光光度计，波长540nm，光径1cm，以调零，测定各管吸光度。 ⑵高脂血症血清会干扰比色。可采用丙酮沉淀出蛋白质或用乙醚抽提脱脂后再作测定。 ⑶属技术性溶血标本应重新采血，属病理、生理性溶血标本只能通过设置标本空白管来消除溶血的干扰。 ⑷一些氨基酸和肽类缓冲液，如Tris缓冲液，可产生阳性显色反应，不宜采用。 【】 135～190℃ NH3↑ △ Cu2+ OHˉˉ NH2 O=C NH O=C NH2 NH2 C=O HN C=O H2N Cu2+ 紫红色络合物 + NH2 O=C NH2 尿素 NH2 O=C NH2 双缩脲 NH2 O=C NH O=C NH2 ［A］ Cu2+ OHˉ O C R CH O C R CH NH NH 蛋白质等含肽键化合物 O C R CH O C R CH NH NH C O HC R C O HC R HN HN Cu2+ 紫红色络合物 ［B］ ×标准液蛋白质浓度 AUARB－AB 血清总蛋白（g/L）= AARB－AB