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第二章 基因工程原理 第一节 基因工程的概念及其主要内容 第二节 基因工程中的工具酶 第三节 基因克隆的质粒载体 第四节 目的基因的分离 第五节 基因与载体的重组与导入受体细 胞 第六节 重组体的筛选 第一节 基因工程的概念及其主要内容 基因决定性状（一）青霉菌能产生对人类有用的抗生素——青霉素 基因决定性状（二) 家蚕能够吐出蚕丝为人类利用 基因决定性状（三） 豆科植物的根瘤能够固定空气中的氮 定向基因改造设想 一 基因工程概念 基因工程：在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。 基因工程(gene engineering)常和以下名称混用 遗传工程(genetic engineering); 基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(gene manipulation); 重组DNA技术(recombination DNA technique) 克隆(clone): 作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系. 作动词时是指基因的分离与重组过程。 二、基因工程的主要内容或（步骤） 1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。 2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。 4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。 5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。 6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 基因工程过程示意图 由此可见，一个完整的基因工程包括基因的分离、重组、转移，基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程。基因工程的实施至少要有4个必要的条件：工具酶、基因、载体和受体细胞。 三、基因工程技术及其应用 第二节 基因工程中的工具酶 基因工程的工具酶就其用途可分为3大类，即限制性内切酶、连接酶和修饰酶。 2.1 限制性内切酶 限制性内切酶(restriction endonuclease)是一类以环状或线形双链DNA为底物，能识别DNA中特定的核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具有3′-OH和5′-P集团DNA片段的内脱氧核苷酸酶。 2.1.1限制性内切酶在DNA分子上的识别序列 限制性内切酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序称之为识别序列，有时称之为识别位点。识别序列多数由4、5、6个核苷酸组成，如DpnⅠ、ApyⅠ和EcoRⅠ的识别序列分别是 GATC、CCTGG和GAATTC。 2.1.2 限制性内切酶的酶切位点 限制性内切酶具有特定的酶切位点，即限制性内切酶在其识别序列的特定位点对双链DNA进行切割，由此产生特定的酶切末端。 不同限制性核酸内切酶切割的三种情况 1.产生3′突出粘性末端（cohesive end):以EcoR I为例： 5′---G AATTC---3′ 5′---GP OHAATTC---3′ 3′---CATAAA G---5′EcoR I 3′---CTTAAOH PG---5′ 2.产生5′突出粘性末端:以Pst I为例： 5′---CTGCA G---3′ 5′---CTGCAp OHG---3′ 3′---G ACCTC---5′ Pst I 3′---GOH p ACGTC---5′ 3.产生平末端（blunt end): 以Nru I为例： 5′---TCG CGA---3′ 5′---TCGp OHCGA---3′ 3′---AGC GCT---5′ Nru I 3′---AGCOH pGCT---5′ 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。 几种最常用的限制性核酸内切酶 2.1.3 限制性内切酶反应系统 限制性内切酶反应底物是DNA分子，但只含识别序列的寡核苷酸是不会被切割的。如只含GAATTC的寡