基因工程与体外表达幻灯片.pptVIP

第八章 基因工程与体外表达 Gene Engineering and Gene Expression 曾海涛 中南大学生命科学学院 分子生物学研究中心 ;目的要求 掌握：限制性核酸内切酶的概念与特点；质粒载体的特点；基因克隆的基本过程。 了解：其他常用工具酶的特点。 【重点】基因克隆的基本过程。; 基因工程是指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节因子（如启动子、增强子等），以及研究基因的功能等。 ;?????第一节 基因克隆的工具酶 一、限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。 ; 限制性核酸内切酶的特点 类型 限制性 修饰作用 识别位点 切割位点 Ⅰ型 有 有 特异 识别位点下游100到1000bp Ⅱ型 有 无 特异 可知、固定 Ⅲ型 有 有 特异 识别位点附近切割DNA， 切割位点很难预测。;2．限制性内切酶的命名 EcoRⅠ E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株 ;5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ ;PstⅠ切割后产生3ˊ黏性末端：;二、 T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase） 催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或平端的DNA两端连接起来。 ; 第二节 基因克隆的载体 ;一、常用的克隆载体 (一)质粒（plasmid） 是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。 ;作为克隆载体的质粒应具备下列特点： （1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存 在，有较高的拷贝数。;;(二)λ噬菌体 野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多种克隆载体。 λ噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。 目前应用较广的是EMBL系列、λgt系列和Charon系列等。 ; λgt10和λgt11载体适用于建立cDNA文库。这两个载体都属插入型载体，能克隆7kb以下的外源DNA。 λ gt11为表达型载体。;(三) M13噬菌体 (M13 phage) 一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。 感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。 ;17;(四)黏性质粒（cosmid） 是由λ噬菌体的黏性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其克隆容量可达40～50 kb。 ;(五) 病毒载体 逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及pBR322的复制子组成。 ;二、表达载体 (一) 原核表达载体 表达载体中含有复制起始位点、抗性基因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结合位点和转录终止信号。; multiple cloning site;(二) 真核表达载体 含有原核复制起始位点、抗生素抗性基因. 还含有真核表达元件,包括启动子、增强子、克隆位点、 转录终止信号和poly (A) 加尾信号.; 第三节 基因克隆的基本过程 ? 基因克隆主要步骤： ①制备目的基因和选择相关载体 ②目的基因和有关载体进行连接 ③重组的DNA导入受体细胞 ④DNA重组体的筛选和鉴定 ⑤DNA重组体的扩增、表达和其他研究; （二）从cDNA文库中获得;几种常用克隆载体的比较 ;三、DNA分子的体外连接 ;（一）黏性末端;（二）人工接头;（三）加入同聚体尾;（四）平端连接;四、外源DNA导入宿主