体外环境下纳米细菌与大肠杆菌促结石的协同作用.pdfVIP

体外环境下纳米细菌与大肠杆菌促结石的协同作用1 张雷，李永国 中南大学湘雅二医院，长沙（410011） E-mail ：raymd728@ 摘 要：目的：通过对纳米细菌和大肠杆菌的混合培养后在不同培养条件下的生长状况，菌 液涂片的茜素红钙染色情况的分析，及培养上清中的β-葡萄糖醛酸酶的定量分析，以期发 现纳米细菌和大肠杆菌相互作用、协同促进结石形成的证据。 方法：进行纳米细菌和大肠杆菌混合培养，对培养物采用茜素红钙染色及 β-葡萄糖醛酸酶 的测定，探讨纳米细菌与大肠杆菌的相互作用以及其机制。 结果：纳米细菌与大肠杆菌混合培养后，培养瓶中出现白色钙化样物质，菌液在琼脂板上传 代培养后发现混合培养菌落周围有白色粉末颗粒，混合培养菌液涂片发现部分大肠杆菌茜素 红钙染色呈阳性（30 ％±2 ％），高于大肠杆菌单独培养组（P0.01 ）；纳米细菌与大肠杆菌混 合培养后检测未发现大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸酶分泌增加（P0.05 ）。 结论：短时间的混合培养后，纳米细菌通过直接附着和侵入大肠杆菌的方式引起大肠杆菌发 生生物矿化作用；尚没有证据支持纳米细菌是通过促进大肠杆菌产生 β-葡萄糖醛酸酶这条 途径增强其促成石能力。 关键词：胆囊结石，纳米细菌，大肠杆菌 1. 引言 细菌在胆囊结石形成中的作用现今已经得到了广泛的认同，尤其是大肠杆菌在胆囊结 石的形成过程中发挥着十分重要的作用。它产生的β-葡萄糖醛酸酶能水解胆汁中的结合胆红 [1] 素为非结合胆红素，促使胆红素钙的形成 。纳米细菌于1989年被芬兰科学家Kajander发现， 因其独特而强大的生物矿化能力，提示其与胆囊结石、肾结石、动脉粥样硬化等多种骨骼外 钙化性或硬化性疾病有关，引起了科学界极大的关注[2] 。文宇等人在胆固醇胆囊结石病人的 胆汁、血浆和胆囊粘膜都分离到了纳米细菌[3] 。王利民等人用纳米细菌成功地建立了胆囊黑 色素结石的动物模型，为纳米细菌参与了胆囊色素结石的形成这一假设提供了有力的证据 [4] 。 最近，Kajander等人对纳米细菌和大肠杆菌的混合培养初步发现纳米细菌能附着并进入 大肠杆菌内部，而且混合培养时菌膜的形成速度更快[5] 。但是目前尚无有关纳米细菌和大肠 杆菌相互作用、协同促进结石形成的研究。本文通过对纳米细菌和大肠杆菌混合培养后相互 作用的观察，以期找寻二者在共生及促进结石形成的证据,为研究胆囊结石形成过程及其成 核机制提供新的切入点，并为胆囊结石防治研究提供一些新线索。 2. 材料与方法 2.1 培养基的配制 将 1640 培养基用 0.22 µm 滤菌器将量瓶内培养基过滤，然后分装到 500 ml 盐水瓶中密 封，标记，4 ℃冷藏。细菌培养前将其与经40 nm 过滤的特级胎牛血清按照体积比 9:1 的比 例混合。 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金的资助。 - 1 - 2.2 纳米细菌和大肠杆菌的混合培养 （1）纳米细菌和大肠杆菌菌株的活化 将保存的纳米细菌菌株 Se90 （芬兰Kajander 教授惠赠）解冻后接种至适量的培养基中， 置于细胞培养箱中静置培养 24 小时，培养箱设置为 37℃，5%CO2 和 95%空气。将保存的大 肠杆菌菌株（Escherichia Coli DH5 alpha ）（医院检验科提供）接种至琼脂平板上，置于细胞 培养箱中静止培养 12 小时，培养箱设置为 37℃，5%CO 和 95%空气。 2 （2 ）大肠杆菌和纳米细菌悬液的配制 将活化后的纳米细菌离心（13200 rpm/min，5 min，4 ℃），去上清，用PBS 液按 1：2 ， 1：4 ，1：8，1：16，1：32 等浓度梯度稀释并用酶标仪测定 650 nm 波长下的吸光值，选择 OD 值为 0.02 时的稀释浓度将其用培养基稀释，