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辣根过氧化物酶在双功能环氧载体和胺基载体上的固定化及固定化酶催化氧化性能研究-应用化学专业论文
原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在指导教师的指导下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名:日期:关于学位论文使用权的说明本人完全了解中北大学有关保管、使用学位论文的规定,其中包括:①学校有权保管、并向有关部门送交学位论文的原件与复印件;②学校可以采用影印、缩印或其它复制手段复制并保存学位论文;③学校可允许学位论文被查阅或借阅;④学校可以学术交流为目的,复制赠送和交换学位论文;⑤学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密学位论文在解密后遵守此规定)。签名:日期:导师签名:日期:辣根过氧化物酶在双功能环氧载体和胺基载体上的固定化及固定化酶的催化氧化性能研究 摘要酶是一种高效、高度专一的生物催化剂。随着科学技术的发展,酶的应用越来越 广泛。但是,酶的稳定性差,对高温、有机溶剂或极端pH敏感,限制了酶的利用。 酶固定化技术的出现,为酶的应用开辟了广阔的应用前景。酶的固定化研究和应用在 工业生产、化学分析、医药和环境工程等众多领域都备受关注。辣根过氧化物酶(HRP)是一种含有血红素辅基(铁原卟啉)的糖蛋白复合酶, 具有特殊催化氧化性能,可以在较为宽泛的条件下催化氧化芳香类化合物,尤其对水 介质中的酚类及苯胺类化合物的氧化反应具有良好的催化作用。含酚工业废水对水环 境的生态平衡和人类的健康都造成严重的危害,采用固定化的辣根过氧化物酶来处理 酚类废水,在环境保护和酶工程领域都是重要的研究课题。研究制备性能良好的载体, 高效地固定辣根过氧化物酶,并将固定化辣根过氧化物酶应用于含酚废水的催化氧化 降解处理,是重要的环境治理与环境保护技术。本课题通过分子设计,研究制备了两类新型的双功能环氧载体,深入研究了对辣 根过氧化物酶的固定化特性与固定化机理,也采用胺基载体对辣根过氧化物酶实施了 固定化,研究了酶学性质,并将固定化辣根过氧化物酶用于苯酚的催化氧化,考察研 究了催化氧化特性。本课题的研究在酶固定化领域具有明显的科学意义,对于酶催化 技术在环境工程中的应用,具有重要的参考价值。首先,采用“接出法”将甲基丙烯酸缩水甘油酯(glycidylmethacrylate,GMA)接 枝聚合在硅胶表面,制得了接枝微粒PGMA/SiO2,又通过环氧基团的开环反应,将乙 二胺(EDA)键合在接枝微粒表面,制备了阳离子型双功能复合载体EDA-PGMA/SiO2(第一种载体),共价偶联法实施了辣根过氧化物酶的固定化;重点考察了两种次价键 力(静电相互作用与疏水相互作用)在共价键合法固定HRP过程中的作用,探索研究了作用机理。研究结果表明,在水介质中,复合载体EDA-PGMA/SiO2表面胺基的质子化 作用,使载体微粒的zeta电位在较大的pH范围内保持正值;当介质的pH=8.5,大于HRP 的等电点(等电点为8)时,酶蛋白与载体之间所产生的强静电相互作用,会显著促进 HRP的固定化;EDA的键合率在30%附近的载体,静电相互作用对固酶的促进作用最 强,固定化酶的偶联率与比活力具有最高值,分别为57.85%和0.257U?g-1·min-1。疏水 相互作用对化学法固定辣根过氧化物酶,也会产生明显的作用,当以接枝微粒 PGMA/SiO2为载体时,增大溶液中NaCl的浓度,可有效促进酶蛋白与载体之间的疏水 相互作用,提高固定化酶的偶联率与比活力。接着,以对羟基苯磺酸钠(SHBS)为试剂,使接枝大分子PGMA的部分环氧基团 发生开环反应,制备了阴离子型双功能复合载体SHBS-PGMA/SiO2(第二种载体),并 采用共价偶联法实施了辣根过氧化物酶的固定化;重点考察了HRP与载体SHBS-PGMA/SiO2之间的静电相互作用在共价固定HRP过程中的作用,并探索研究了 作用机理。研究结果表明,复合载体SHBS-PGMA/SiO2表面大量的磺酸根离子,使其 zeta电位在较大的pH范围内显示很大的负值,即SHBS-PGMA/SiO2表面携带高密度的 负电荷。当pH=6.0,HRP分子荷正电,酶蛋白分子与载体之间会产生很强的静电相互 作用,显著促进HRP的固定化;当载体表面SHBS的键合率在18%附近时,静电相互作 用对固酶的促进作用最强,固定化酶的偶联率与比活力达最高值,分别为63.64%和 0.27U?g-1·min-1。催化氧化实验表明,以上述两种环氧载体固定的辣根过氧化物酶催化活性不高, 于是又采用胺基载体(二乙烯三胺改性的交联聚丙烯腈微球,DETA-CPAN),以戊二 醛为偶联剂,实施了辣根过氧化物酶的固定化,考察了最适酶固定化条件。研究结果 指出,最适固定化条件为:温度为30℃,固
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