WesternBlotting步骤及试剂.doc

各种组织的Western Blotting步骤及试剂 缓冲液 PBS 8 g nacl 0.2g kcl 1.15g na2hpo4 0.2g kh2po4 溶于800ml蒸馏水，调PH至7.4，再加蒸馏水定容至1L。高压灭菌后室温保存。 TBS 8 g nacl 0.2g kcl 3.0g Tris 碱 溶于800ml蒸馏水，用1M Hcl调PH至8.0，再加蒸馏水定容至1L。高压灭菌后室温保存。 10X TBS储存液 500mM Tris-HCL PH7.4 1.5 M nacl 细胞裂解液 NP-40 裂解缓冲液 50mM Tris,PH8.0 150mM Nacl 1% NP-40或（TritonX-100） 加新鲜配制的蛋白酶抑制剂 RIPA缓冲液 50Mm Tris,PH8.0 150Mm Nacl 1% NP-40或（TritonX-100） 0.5%脱氧胆酸钠 0.1%SDS 加新鲜配制的蛋白酶抑制剂 蛋白酶抑制剂 工作浓度 抑制的蛋白酶 Aprotinin 1-2ug/ml 胰蛋白酶，糜蛋白酶，纤溶酶，激肽释放酶 EDTA 1-2 mM 金属蛋白酶（mg2+和Mn2+） EGTA 1 mM 金属蛋白酶 (Ca2+) Leupeptin 0.5-2ug/ml 胰蛋白酶，纤溶酶,木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B Pepstatin A 1ug/ml 胃蛋白酶，组织蛋白酶 PMSF(剧毒) 50-100ug/ml 丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶 电泳和转移缓冲液 Laemmli 2X 样品缓冲液 4%SDS 20%甘油 125 mM Tris,PH6.8 0.02% 溴酚蓝 200mM DTT或10%βME (β-巯基乙醇) 为获最佳结果，DTT或βME需在用前新鲜配制，添加。 凝胶电泳跑胶缓冲液 25mM Tris碱 190 mM甘氨酸 0.1%SDS 转移缓冲液 50 mM Tris碱 380 mM甘氨酸 0.1%SDS 20%甲醇 丽春红S储存液 2%丽春红S 30%三氯乙酸 30%磺基水杨酸 用前10倍稀释于蒸馏水 洗涤缓冲液 PBST 含0.1% Tween20的PBS TBST 含0.1% Tween20的T BS Block Ace 洗涤缓冲液 将每管4g复溶于100ml蒸馏水。将复溶后的试剂10倍稀释，并加Tween20至终浓度0.05-0.2%V/V 封闭缓冲液 当用抗磷蛋白抗体检测、或用抗生物素的二抗检测生物素标记的一抗时，使用BSA或Block Ace封闭。 含5%脱脂奶粉的PBST或TBST （Blotto） 在100ml PBST或TBST中加5g脱脂奶粉。轻柔搅拌溶解。4度保存。 含3%BSA的PBST或TBST 在100ml PBST或TBST中加3gBSA Fraction V。轻柔搅拌溶解。4度保存 Block Ace 将每管4g复溶于100ml蒸馏水，无需稀释即可使用。 操作步骤 细胞裂解----哺乳动物细胞 关于酵母和细菌细胞裂解方法查阅Sambrook et al 或Harlow and Lane 贴壁细胞： 将冷PBS加入组织培养瓶或培养皿中轻轻摇动，直接洗细胞。吸出PBS，重复洗涤，始终将组织培养皿置于冰上。 在培养瓶中加入适当体积的冰冷裂解缓冲液(含有新鲜配制的蛋白酶抑制剂)，100mm的组织培养皿加约1ml。（或者用胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养瓶移出，再按上述细胞裂解方法制备。） 在冰上孵育20分钟，然后用橡皮刮从培养皿表面将细胞刮下。 转移至微量离心管，4度12000转 离心10分钟，澄清裂解物。 将上清液转移至新管，冰上保存，或-20度或-80度冻存。 悬浮细胞： 吸取细胞至新圆锥底管子，置冰上。 4度低速离心细胞，吸弃培养基。 加10ml冰冷PBS,轻轻翻转管子洗细胞。 低速离心细胞，吸弃上清。 重复洗细胞和吸弃上清。以5ml冰冷PBS重悬细胞。 计数细胞; 4度低速离心使细胞沉淀成块，吸弃液体。 在冰冷的细胞裂解缓冲液（含有新鲜配制的蛋白酶抑制剂）中轻轻悬浮细胞块，107细胞加1ml缓冲液。 在冰上孵育细胞30分钟。如有必要，在冰上超声处理裂解物15-30S以破坏基因组DNA和细胞组分。 转移至微量离心管，4度12000转离心10分钟，澄清裂解物。 将上清液轻轻倒入新管，弃去细胞团块。若即用则冰上保存，或于-20度或-80度冻存至用时。 凝胶上样前，用BCA,Lowry或Bradford检测法或通过吸光值测量蛋白浓度。 组织样本： 组织样本被解剖后立即在冷PBS中漂洗，并置于冰上的管中。 对于晓得组织样本（100mg），用干净的解剖