分析不同pH下重组蛋白R1R2和R1R2CT二级结构特性.docVIP

分析不同pH下重组蛋白R1R2和R1R2CT二级结构特性 　　蜘蛛丝拥有优异的机械和生物学性能，是一种理想的多功能材料。由于蜘蛛自相捕食和产丝量小等，通过驯养蜘蛛获取大量蛛丝纤维的难度较高，因此采用生物技术的方法重组表达蜘蛛丝蛋白成为获取仿生蜘蛛丝纤维的主要途径。 　　到目前为止，在蛛丝仿生领域仍未取得突破，仿生的拟蛛丝纤维性能远不及天然蛛丝。研究表明蛛丝蛋白的高分子量特性和成丝模式是决定丝纤维性能的重要因素，现已成为研究的热点。典型的蛛丝蛋白由氨基端(N terminal，NT)、羧基端(C terminal，CT)以及占到90%的重复区(Re－peat，R)构成。NT 和 CT 高度保守，在蛛丝蛋白的分泌、储存和成丝等过程中起重要的调节作用。 　　随着 pH 的降低(中性到酸性)，NT 二聚化，形成蛋白网络；CT 则能促进蛛丝蛋白的排列和可溶性的提高等，具体功能尚不清楚；R 主要与蜘蛛丝性能相关。另外，蛛丝蛋白纤维化还受到盐离子的影响，如氯化钠能够维持主壶腹腺丝蛋白(major ampullate spidroin，MaSp)NT 单体的稳定性等。由于主壶腹腺体容易分离，分泌的主壶腹腺丝性能突出等优点，长期以来一直受到青睐。 　　2012 年本课题组获得首条次壶腹腺丝蛋白(Minorampullate spidroin，MiSp)全长编码序列，经比对分析得知 MiSp 和 MaSp 的 CT 同源性较高，但MaSp CT 含有两个保守半胱氨酸(Cysteins)，通过二硫键相互作用，形成平行二聚体；MiSp CT 则没有 Cys，二聚化机制和生物学功能尚未得到充分证实。 　　为了进一步研究蜘蛛丝蛋白 MiSp 重复区 R和羧基端 CT 的二级结构和功能，本实验通过克隆并在大肠杆菌 Rosetta 2(DE3)中分别表达R1R2CT和 R1R2 两个组合模块蛋白，借助 Ni-NTA 亲和色谱纯化，利用圆二色谱(circular dichroism，CD)测定并分析了不同 pH 条件下的重组蛋白 R1R2和 R1R2CT 二级结构特性；采用扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM) 表征 R1R2 和R1R2CT 重组蛋白在不同 pH 及离子条件下的聚集和成丝情况，为成丝机理的研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　质粒抽提试剂盒、DNA 胶回收试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司；EcoR、Hind、Bsa限制性内切酶和 phusion High-Fidelity PCRMM buffer 购自 NEB 公司 (美国)；T4 DNA 连接酶购自 Fermentas 公司 (美国)；6×his 抗体购自天根公司；Ni-NTA 树脂购自 Qiagen 公司(德国)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 克隆构建 　　以 MiSp 全长基因为模板 (GenBank 登录号: 　　JX513956)，以 R1p1 和 R1p2 为引 物 PCR 扩增R1，以 R2p1 和 R2p2 为引物 PCR 扩增 R2。Bsa酶切 R1 和 R2，酶切片段回收后由 T4 连接酶体外连接 R1 和 R2；以连接产物为模板，以 R1p1 和R2p2 为引物扩增 R1R2；R1R2 由 EcoR和 Hind 酶切，胶回收后的酶切片段与拥有相同酶切位点的载体连接。以 R1R2 为模板，以 R1R2p1 和R1R2p2 为引物扩增片段 R1R2，以 CTp1 和 CTp2为引物扩增 CT；R1R2 和 CT 分别由 Bsa酶切，酶切片段回收后体外连接，连接产物用作模板，以R1R2p1 和 CTp2 为引物扩增 R1R2CT， 产 物经EcoR和 Hind酶切后与载体连接，引物序列见表 1，具体克隆构建过程如图 1。 　　 ?　　1.2.2 融合蛋白的表达 　　将测序正确的重组质粒转化于 Rosetta 2(DE3)感受态细胞。挑取单克隆接种于 5 mL LB 培养基(含卡那霉素 30 mg/L)。200 r/min，37 过夜培养。将 5 mL 过夜培养物接种于 500 mL 新鲜LB 培养基 (含卡那霉素 30 mg/L)，37 震荡培养至 OD600为 0.9 左右，温度降至 25 时加入终浓度为 0.3 mmol/L 的 IPTG，25 诱导培养 4 h，离心 10 min (8 000 r/min，4 )收集菌体，加入 30 mL20 mmol/L Tris pH 8.0 重悬菌体，200 W 超声破碎(超声 5 s，间隔 8 s)60 次，低温高速离心 30 min(12 000 r/min，4 )收集上清。 　　1.2.3 蛋白表达产物纯化和分析 　　上清中重组蛋白与 Ni-NTA 结