SDS-PAGE分离胶-浓缩胶配方.docxVIP

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2018-05-12 发布于福建
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SDS-PAGE分离胶-浓缩胶配方.docx

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SDSSDS：聚丙烯酰胺凝胶电泳Acr：丙烯酰胺；配胶时用30%Acr（质量比Acr：Bis=29:1）Bis：甲叉双丙烯酰胺DDW：超轻水SDS：十二烷基硫酸/磺酸钠，阴离子去污剂（配胶时用10%）APS：过硫酸铵NH4S2O4配胶时用10%TEMED：四甲基乙二胺，促凝剂Tris-Hcl：3羟基氨基甲烷盐酸缓冲液，配胶时（分离胶ph=8.8，浓缩胶ph=6.8）DTT：二硫苏糖醇，DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的/item/%E5%8D%8A%E8%83%B1%E6%B0%A8%E9%85%B8半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。IMA：碘乙酰胺，碘代乙酰胺用于有机合成，在蛋白组学中组氨酸和半胱氨酸的烷基化试剂，用于多肽测序以及酶抑制剂等，蛋白组学级试剂。　CH2ICONH2，是和碘乙酸一样，可通过下列反应不可逆地抑制SH酶类的物质。根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS的分离胶(即下层胶)： SDS分离胶浓度最佳分离范围6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD成分配制不同体积SDS分离胶所需各成分的体积（毫升）6%胶51015203050蒸馏水2.04.06.08.012.020.030%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.06.010.01M Tris,pH5.77.611.419.010%SDS0.00.30.510%过硫酸铵0.00.30.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.0240.04成分配制不同体积SDS分离胶所需各成分的体积（毫升）8%胶51015203050蒸馏水6.710.016.730%Acr-Bis(29:1)5.38.013.31M Tris,pH5.77.611.419.010%SDS0.00.30.510%过硫酸铵0.00.30.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不同体积SDS分离胶所需各成分的体积（毫升）10%胶51015203050蒸馏水5.38.013.330%Acr-Bis(29:1)6.710.016.71M Tris,pH5.77.611.419.010%SDS0.00.30.510%过硫酸铵0.00.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS分离胶所需各成分的体积（毫升）12%胶51015203050蒸馏水1.02.03.04.06.010.030%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.012.020.01M Tris,pH5.77.611.419.010%SDS0.00.30.510%过硫酸铵0.00.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS分离胶所需各成分的体积（毫升）15%胶51015203050蒸馏水0.51.01.52.03.05.030%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.015.025.01M Tris,pH5.77.611.419.010%SDS0.00.30.510%过硫酸铵0.00.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。按照如下表格配制SDS的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)：成分配制不同体积SDS浓缩胶所需各成分的体积（毫升）5%胶2346810蒸馏水30%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31.71M Tris,pH80.50.751.01.2510%SDS0.020.030.040.060.080.110%过硫酸铵0.020.030.040.060.080.1TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.01TBST 缓冲液每2L体积中含：1M TrisHCL(pH7.5)100mLNacl16gKCL0.4g吐温1ml抗体去除液每50mL抗体去除液中含：0.5M TrisHCL（pH6.8）6.25mL10%SDS10mLBeta-ME0.175mL水33.75mLSDS电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和