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* 整合载体：允许外源DNA插入，并在转化后整合到宿主细胞基因组中。整合是通过质粒与受体细胞中同源序列间发生的同源重组介导的。 细菌整合载体（根癌农杆菌Tｉ质粒可被用来将DNA整合到植物基因组中） 酵母整合载体： 哺乳动物整合载体：病毒为基础 * 质粒DNA的制备 质粒：是、染色体外的小型环状分子，大小2-200kb，在宿主细胞内有多个拷贝。 含有复制起点可进行自主复制；一般质粒含有几个基因，其中之一会赋予细菌对抗生素的抗性。 例如： ampr基因编码降解青霉素类抗生素如氨苄青霉素的ｂ－内酰胺酶。tetA基因编码一种可以从细胞内将四环素类抗生素排除的跨膜泵蛋白。 * 技术； 质粒的制备； 酶切； 琼脂糖凝胶电泳； DNA连接； 转化； 筛选 * 质粒的小量制备： 质粒：质粒~2-20 kb 的长度远远小于大肠杆菌染色体DNA (4600 kb)，独立的超螺旋结构。 小量制备质粒： 含质粒大肠杆菌细胞的培养； 离心菌液收集菌体沉淀； 碱裂解：悬浮细胞沉淀，碱裂解，中和； 酚抽提去除蛋白杂质； 乙醇沉淀核酸。 * 碱裂解： 在缓冲液中重新悬浮细胞； 溶菌酶降解细菌细胞壁； 在裂解缓冲液中裂解细胞，裂解缓冲液含有SDS和NaOH, SDS的作用是破碎细胞膜及引起蛋白质变性。 NaOH的作用是使DNA变性和水解RNA。 中和缓冲液：含KAc (pH 5)，其作用是沉淀已变性的蛋白质和染色体DNA及大部分去污剂。复性超螺旋质粒DNA。染色体DNA不能复性是因为其大小和易于被剪切的物理特性。 * 限制性内切核酸酶 20世纪60年代和70年代初鉴定了限制性内切核酸酶 限制性内切核酸酶来自细菌，可将DNA酶切成特定的、可再生的片段。 限制性内切核酸酶的发现及鉴定是实现DNA克隆的关键。 * 限制－修饰系统 许多细菌含有限制－修饰系统。是细菌对侵入细胞的外源DNA的天然防御机制。 限制性内切核酸酶：识别一小段对称的DNA序列，在识别位点处切割（水解）双链DNA骨架。 识别序列：识别序列为4～8 bp，绝大多数识别序列为6bp，在随机序列DNA中平均每46=4096 bp长存在一个6bp的识别序列。 高度特异性：限制性内切酶对识别位点的高度特异性保证了将大片段DNA分子及载体切割成特定片段，且重复性好。 酶切产物是具有３‘或５’突出的末端或平末端。新形成的５‘端总是保留这磷酸基团。 甲基化酶：对细胞DNA的相应识别序列内的C或A进行甲基化。这种修饰作用可以保护宿主细胞DNA不被内切酶降解。 * 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取的一种多糖。当以0.5%-3%的浓度溶解于水溶液后可形成固体凝胶。 * 在有5‘－P时，DNA连接酶可共价连接配对碱基的黏性末端或平头末端。 由ATP水解提供能量，将dsDNA的戊糖－磷酸骨架的5‘-磷酸与3’－羟基相结合。 * 感受态细胞： 用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。 用于制备感受态的大肠杆菌细胞是不能表达限制修饰系统的特定菌株。 转化：感受态细胞吸收外源DNA的过程。 转化效率：每毫升用于转化的质粒DNA在选择平板上所形成的具抗生素抗性的菌落数。 转化率的变动幅度从粗放转化程序103/μg ～ 精细转化程序108/μg。约105/μg 的转化率足以满足简单的克隆实验。 热激：感受态细胞吸收DNA后，将其混合液于42oC热激1~2分钟，会诱导涉及DNA修复的酶及其它细胞成分的生成。有利于细胞从转化过程中的不正常状态下恢复过来，提高转化效率。 * 鉴别环化载体分子与重组质粒是分子克隆中非常重要的步骤。 自环化载体分子可通过从转化克隆中小量提取质粒、酶解、琼脂糖凝胶电泳与重组体相区分。 双抗生素抗性筛选 蓝－白斑筛选 * lacZ，该基因编码β－半乳糖苷酶，受lac启动子的调控。当E.coli菌株表达Lac阻抑物，则载体上的lacZ 基因由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(1PTG)诱导表达，表达形成的酶可以利用底物 5－溴－4－氯－3－吲哚－ β－D－半乳糖苷(X-gal)形成一种蓝色化合物。重组质粒中lacZ的插入失活将导致不能形成蓝色菌落。 lacZ’是lacZ截短后的衍生物，此基因编码β－半乳糖苷酶的N端的α肽。这种载体须转入一种含有表达β—半乳糖苷酶的C端部分的突变基因的宿主菌，表达的β－半乳糖苷酶的C端能与α肽互补产生有活性的酶。 * 克隆片段在MCS中的定位使得目的基因的编码区与lacZ‘基因具相同的可读框，并且是连续不间断的。在诱导 启动子转录后，产生融合蛋白，该融合蛋白是由来自lacZ’的N端的几个氨基酸及其紧连着的由插入片段所编码的蛋白序列组成。 组氨酸标签表达载体：在表达蛋白ORF的N端加上一段组氨酸编码序列，以使 重组蛋白可通过与Ni色谱柱的特异结合被纯化出