5.4细胞工程第五章.pptVIP

5.3基本原理 对于植物细胞而言，首先将体细胞经酶解除去其细胞壁，得到原生质体；而后通过物理或化学方法诱导其细胞融合形成杂种细胞；继而再进行杂种细胞的分检和培养，促使种间的转移。 在适宜的条件下来培养，长成的生物个体就是一个新的物种或品系。 细胞融合的发展历史 1858年菲尔绍夫（Virchow）途述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞情况。1875年兰格（lange）第一个观察到血液细胞中的合并现象。1962年日本冈田善雄发现HVJ能引起细胞的融合现象。1965年英国海利斯等进一步证实了灭活的病毒在适当条件下可以诱发动物细胞融合。20世纪70年代初高国楠发现聚乙二醇（PEG）能促进植物原生质体融合。 5.4融合材料 5.4.1植物或微生物原生质体的制备 除去细胞壁后获得原生质体，因此也称原 生质体融合 5.4.2动物单个细胞获得 组织获得的方法同动物细胞培养，组织消化液常用胰蛋白酶与胶原酶 5.5细胞融合技术 5.5.1生物法——仙台病毒法 很多病毒都具有凝集细胞的能力，它一边黏接在一个细胞表面，另外一边黏接在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒的作用直靠近发生凝结。这就是仙台病毒法的基本原理。 仙台病毒（sendal virus）也称日本血凝病毒HVJ，属黏液病毒副流感类群，是RNA病毒，多型颗粒状，可以使感染细胞表面发生某些改变促使细胞容易发生融合。仙台病毒已成为产生细胞杂种的标准融合剂。 5.5.2化学法——PEG结合高Ca2+、pH诱导法 可能的原理：带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的黏着而结合。用高Ca2+和pH溶液将与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。 基本过程：首先得到两种不同细胞的原生质体在PEG和钙离子的存在下混合，使两种细胞进行融合，细胞壁再生后就得到了融合体。 5.5.3物理法——电融合诱导法 原理：在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而是质膜开始连接，直到闭和完成整的膜形成融合体。 5.5.4细胞融合的影响因素 5.5.4.1植物细胞融合 5.5.4.2动物细胞融合 5.5.4.1植物细胞融合 PEG诱导融合的关键是作用时间。 PEG规格和纯度与融合效率亦有关系。 在电场诱导融合时，融合率与原生质体密度有关。 在融合液中加入小量CaCl2既可维持一定电导率，对细胞也有保护作用；其次交变电流强弱，处理时间长短及电脉冲大小均会影响融合率。 此外，用混合盐溶液对原生质体进行融合前预处理，以及在促融剂中添加伴刀豆球蛋白、二甲基亚砜、胰蛋白酶、精胺或亚精胺等亦可提高融合率。 5.5.4.2动物细胞融合 首先，亲本细胞表面性质影响较大。 细胞种类不同，融合效果也不同。 细胞融合时需要适宜温度和运动状态。 细胞融合过程中，通常耗氧量较大缺氧时经常不融合。 有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋白质亦发生变化。 最适合的pH为7.4-7.8之间。 5.6融合细胞的选择 融合细胞的类型 融合细胞的选择法 融合细胞的类型 同核体：同源原生质体的融合体。 异核体：非同源原生质体的融合体。 多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体。 融合细胞的选择法 遗传互补筛选法 抗性互补筛选法 生长特性筛选法 物理特性筛选法 其他筛选法。 5.7细胞融合技术的应用举例 1972年美国科学家开发出杂种烟草 1978年德国科学家将番茄与马铃薯细胞融合成功（pomato) 1978年培育出含人体染色体的人造小鼠 近年来培育出了绵山羊 5.7细胞融合技术的应用举例 5.7.1动物细胞融合——单克隆抗体生产 5.7.2利用原生质体融合和培养技术培育新植物 5.7.3微生物原生质体融合构建新菌株 5.7.1动物细胞融合——单克隆抗体生产 常规免疫方法制备的免疫血清抗体只能是数目众多的的单克隆的抗体的混合物，一般称其为多克隆抗体。（PcAb） 1975年科学家将小鼠骨瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合发现杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养时能够无限地快速增殖，又能持续分泌特异性抗体，通过克隆化就可以获得结构与各种特性完全相同的高纯度抗体，即单克隆抗体（McAb） 单克隆抗体的制备过程 5.7.1.1细胞融合前准备 5.7.1.2细胞融合与杂交瘤选择 5.7.1.3抗体的检测与杂交瘤选择 5.7.1.4单克隆抗体的大量生产 5.7.1.5单克隆抗体的鉴定