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基因文库的构建 基因组文库 cDNA文库的构建 反转录酶 加接头直接克隆 mRNA的分离 1、寡聚（dT）-纤维素层析法 2、寡聚（dT）-纤维素液相结合离心法 3、磁性球珠分离mRNA 4、寡聚（dT）-纤维素离心柱快速离心法 第一条链的合成 以oligo（dT）（末端加酶切位点）为引物合成 反应条件要依据不同公司生产的反转录酶的最佳反应条件而设置 反应体系要根据产品说明确定 cDNA第一条链的合成效率不高，相对多量的反转录酶及引物可提高第一条链的产率 各种反转录酶只能储存于-20 ℃ 焦磷酸钠、亚精胺 rRNA、tRNA 抑制剂 200u/ug RNA 10-15U/ug RNA 反应活性 抑制 抑制 增加产量 焦磷酸钠 作用很低 作用很低 合成的第一条链3`端有发夹结构 3`端特性 pH8.3 pH7.6 pH8.3 最适反应条件 37℃最高可达45℃ 37℃ 42℃ 最适反应温度 DNA聚合酶活性 DNA聚合酶和弱的RNase H酶活性 DNA聚合酶和强的RNase H酶活性 活性 Superscript反转录酶 M-MLV反转录酶 AMV反转录酶 cDNA 第二链的合成 自身引导合成法 置换合成法 经典 RACE 经典 RACE cDNA末端的快速扩增（ rapid amplification of cDNA ends，RACE）：基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA 5 ’和3’末端的方法 以mRNA为模板，反转录合成cDNA的第一条链，然后用PCR技术扩增出从某个特定位点到3`端或到5`端之间的未知核苷酸序列 经典 RACE 3`-RACE可以利用mRNA的poly（A）尾和GSP（gene-specific primer）设计PCR 5`-RACE则要通过对cDNA第一条链同聚物加尾来实现 5--RACE 3 RACE cDNA克隆方法 1、加尾： 末端转移酶：Mg++以带3`羟基端单链DNA或带3`羟基突出端的双链DNA为加尾模板；Co++平端双链DNA或带3`羟基末端的双链DNA为加尾模板 2、加接头或连接子 3、PCR产物的克隆 * * 常用的载体类型有 ， ， ， ， ， ， 等 复 习 质粒的基本条件 在Lac标记基因插入外源基因，经IPTG诱导，在X-gal培养基中显 色，为 克隆，未插入基因的克隆显 色，为 性克隆 具有α－互补作用的受体细胞是 （1）DH5α （2）HB101 （3）JM109 常用的病毒载体有 ， ， ， 等 Genome Library 基因分离 建库 核酸分离 外源基因的获取 概 述 基因文库：包含有某种生物单倍体基因组中全部遗传信息的一群DNA克隆，这些不同片段长度的DNA克隆按照相邻关系拼接后可以涵盖该生物的全部核酸序列。是将某种生物遗传物质（信息）以整化零方式进行保存和扩增的DNA存在形式 目的：方便对所感兴趣的目的基因的筛选，而不必每次都去提取整个基因组 类型 按基因文库中重组DNA片段所含外源基因的原始特性:基因组文库、cDNA文库 根据载体性质:质粒文库、λ文库和粘粒文库、YAC文库、BAC文库 根据功能：表达文库和非表达文库 基因组文库的构建 基因文库 基因组文库 来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息：用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织形式 cDNA文库 来源于细胞表达出的RNA，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等 基因组文库的大小（库容） N=In(1-P)/In(1-X/Y) 其中： N:克隆数 In:自然对数 X:切割后片断长度 Y:DNA总长度 P:希望概率（常为99%） 例如：哺乳动物基因组长度为3x109 bp,片断长度为17Kb,则克隆数为 N=In(1-0.99)/In(1-1.7x104/3x109) =8.1x105(个) 但实际克隆数均应比理论值大2-3倍 理想的基因文库应满足的条件 （1）包含全部遗传信息：对DNA要求随机切割，有重复片段即侧翼序列