Ch2.生物大分子的制备.pptVIP

南京农业大学 生命科学学院 第二章 生物大分子的制备 生物材料的选择 细胞的破碎 生物分子的抽提 生物分子的浓缩 有效成分纯度和性质分析 * 与一般化学分离法相比： 1、生物材料组成非常复杂，并且在分离过程中仍在进行代谢变化，如蛋白质和核酸的水解。 2、有些化合物的含量极微，如激素等。 3、许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很易变性破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。 4、生化分离制备几乎都在溶液中进行，影响因素很多，实验方法经验性较强。 * 理化性质 分离及纯化方法 分子大小和形态 差速离心、超滤、分子筛、透析 溶解度 盐析、萃取、分配层析、结晶 电荷差异 电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析 生物功能专一性 亲和层析 生物大分子的理化性质 与分离纯化方法的选择 制备方法的选择 以生物大分子的理化性质为依据 理化性质不同，所选用的分离提纯方法也不相同 有效成分含量较高的 提取较容易的 利于保存的 、材料的选择 第一节 材料的选择与处理 （1）冰冻：新鲜的脏器要清洗，去血、脂肪、筋。分 割，包保鲜膜-50～-70℃存放。 （2）干燥：脏器放入丙酮中脱水，干燥后磨粉存放。 （3）匀浆：新鲜匀浆，提取有效成分高。 二、材料的处理 动物脏器 2.植物组织 将表面轻轻擦干，冰箱中-4～-30℃冷冻存放。 3.微生物 菌液用离心法获得离心菌体。 第二节 测定方法 1. 光谱法：分光光度计测定紫外或可见光吸光值 2. 荧光法 3. 浊度法（OD值）：微生物菌液常用测定方法 4. 电化学法：测离子、pH、电压等 5. 生物活性检测 6. 免疫分析法 7. 生物传感器(biosensor)  一、机械破碎 研磨法；组织捣碎法；超声波法；压榨法；冻融法等。 二、化学处理 脂溶性溶剂或表面活性剂可以把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解 三、酶解法 生物酶可以降解细菌细胞壁 第三节 细胞的破碎 四、溶胀和自溶 溶胀：低渗溶液浸泡下，细胞胀破生物膜。 自溶：细胞结构在自身固有的各种水解酶的作 用下发生破裂、溶解。 * 通常指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。 提取液应具备的条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、价格低廉、操作安全等。 第四节 抽提 1、pH合适 2、溶剂的极性和离子强度合适 3、防止水解酶破坏有效成分 4、温度合适 5、轻轻搅拌，有利于提取物与溶液接触 6、防止氧化 7、防金属离子干扰 8、提取液与提取物比例 = 5:1较合适 抽提有效成分的影响因素： 一、沉淀法 盐析、有机溶剂沉淀法等。 超滤：膜孔在1～10 nm，膜上施加的压差为0.1～0.6 MPa时，可截留生物大分子，除去水和小分子盐类；或截留细菌等杂质，获得清洁的滤液的方法叫超滤。 第五节 浓缩 微孔过滤：当膜孔在50 nm～14μm，膜上施加的压差为0.1 MPa时，可截留细菌等杂质，获得清洁的滤液的方法。 二、过滤法 电渗析 膜上带有特定的电荷，在电场作用下，吸附溶液中的反向电荷物质，从而使带电物质吸附在膜上，与溶液中非离子分子或反向电荷物质分离。 三、吸附法 四、透析法 五、减压蒸馏法 六、冷冻干燥法 将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质由于膜两边的浓度梯度而不断扩散到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。 第六节 有效成分纯度和性质分析 * 鉴定生物制品纯度的方法：电泳、免疫分析、薄层层析等 检测含量和性质的方法：光谱法、气象色谱等 测定有效成分分子质量的方法：凝胶过滤、电泳、超速离心等 核酸序列测定的方法：化学直读法、酶解直读法等 测定蛋白质序列的方法：Edman降解法相结合的薄膜层析等 第二节 提取缓冲液 、酶类提取缓冲液要求 pH值： （1）应偏离酶的等电点，以利于酶溶解。 （2）酶不会被降解。 2.缓冲剂 （1）缓冲能力好，存放时间较长。 （2）对酶的提取、保存有利。 （3）不影响检测。 3. 离子强度和极性的控制。 高盐缓冲液虽然对缓冲力稳定有利，能保持一定的pH值，但对酶的溶解度可能不利。 适当降低缓冲液极性，对低温下保存酶有利，样液尽量不要结晶。 加入甘油、非还原性的蔗糖等能防止样液在低温冰箱中结晶。 离子强度 溶解度 盐溶 盐析 （1）碘乙酸、碘乙酸胺，可抑制含-SH活性基团的 蛋白酶类。 （2）EDTA抑制金属蛋白酶类。 （3）PMSF（苯甲基磺酰氟化物）可抑制含Ser活性 基团的蛋白酶类。 （4）抑胃肽，可抑制酸性蛋白酶。 4. 添加蛋白水解酶抑制剂 （1）保护具有-SH的酶类试剂 如β-巯基乙醇、DTT（二硫苏糖