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荧光分析法测定 维生素B2片剂中核黄素的含量 中级化学实验(第二版)P89 浙江大学化学系 一、荧光分析法测定基本原理  （一）定性分析——根据激发曲线、发射曲线的特性  （二）定量分析——稀溶液中，荧光强度与浓度成正比  （三）荧光分析法的特点——灵敏度高，选择性好。 （一）定性分析 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线  固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光 (磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线 I ）。  激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多， 荧光强度最大；通过激发光谱，选择最佳激发波 长——发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长，常用 λex表示。 2. 荧光光谱(或磷光光谱) 固定激发光波长(选最大 激发波长), 化合物发射的荧光 (或磷光强度)与发射光波长关 系曲线(图中曲线II或III)。通过 发射光谱选择最佳的发射波长 ——发射荧光(磷光)强度最大 的发射波长，常用λem表示. 荧光发射光谱 磷光光谱 荧光激发光谱 200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 3. 激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值 。发射光谱的波长比 激发光谱的长 ，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级 ，吸收不同波长的能量(如能级 图 2 , 1) ，产生不同吸收带 ，但均回到第一激发单重态的最 低振动能级再跃迁回到基态 ，产生波长一定的荧光(如 ‘ ) 2 。 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱 （与激发光谱形状一样 ）成镜像对称关系。 （二）、定量测定 If = 2.3f I0  bc=KC  该式只有bc 0.05时 I = 荧光相对强度 f 才成立，即荧光测定只有  f = 量子效率 在极稀溶液中才可测定，  I0 = 入射光强度 否则校正曲线向浓度轴弯   = 吸收系数 曲。  b = 光程长  c = 浓度 （三）荧光分析法的特点  1. 灵敏度高 前面已述，荧光分析法的灵敏度比吸光分析法高2 ～4个数量级，检 测下限在0.1 ～0.001μg·mL-1之间。主要原因有二：  一是荧光信号是在暗背景下检测的，噪声小，较微弱的信号也能被 检测，且可以高倍放大；  二是荧光强度和激发光强度成正比关系，可以提高激发光的光强以 增大荧光强度。 2. 选择性好 荧光分析法的光谱比较简单，特征性强，而且有激发光谱和发射光谱 ，选 择的余地大。如果某几种物质的激发光谱相似，就可以从它们发射光谱的差 异进行鉴别和分析；相反如果发射光