真核基因组DNA制备(final).docVIP

真核基因组DNA的制备 Seta Lam 2015．09．09 Part One 双链DNA在溶液中随机卷曲，溶液粘滞； 双链DNA在化学上稳定，但在物理上易碎； 在EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase）存在的情况下，用Proteinase K（蛋白酶K）消化细胞或组织，用去垢剂如SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性，通过有机溶剂抽提纯化核酸。污染的RNA通过RNase消化清除，小分子物质通过乙醇去除。该方法可产生数μg～数百μgDNA，制备的DNA长度小于100～150kb，可用于Southern Blot，PCR，构建基因组DNA的噬菌体文库； Part Two Protocol 材料 试剂 裂解液（Lysis Buffer）； 混合后室温保存：10mM Tris-HCl (PH 8.0), 100mM EDTA(PH8.0)，0.5%(w/v) SDS 用前加入：20μg/ml无DNase的RNase， 100μg/ml无DNase 及RNase的Proteinase K, 置于冰上; (用milliQ水补齐) Tris-HCl（1 M, pH8.0）：称量12.12 g Tris 碱，加入80 ml ddH2O 搅拌至溶解，盐酸调节pH 值后定容至100 ml，室温保存。 1×PBS（137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4）: 预冷; 称取2.93 g 十二水磷酸氢二钠，0.2 g 磷酸二氢钾，0.2 g 氯化钾，8 g 氯化钠， 加入900 ml 超纯水搅拌，调pH 值后定容至1 L，高压灭菌后4℃保存。 3.4%PBS: 预冷; 100ml 1×PBS, 2.5g NaCl 3M Sodium Acetate（醋酸钠， PH 6.3）； 20mg/ml Proteinase K：用ddH2O溶解, 储于－20℃； 10mg/ml RNase：用ddH2O溶解, 储于－20℃ TE （PH8.0）：10mM Tris.HCl, 1mM EDTA; 100%, 70% ethanol（用无水乙醇和超纯ddH2O配制）: 预冷; 超纯ddH2O：双蒸水过柱 ； 苯酚（PH 8.0, Tris平衡）； 苯酚/氯仿 （1:1, 用PH8.0平衡酚配）； 氯仿 设备 Eppendorf 5417R离心机 （4℃离心时，离心机需预冷至4℃） 微型掌式离心机 大容量低速离心机 切去约1.5cm枪尖(出口直径约2mm) 的200ul（黄色）宽口吸嘴，高压灭菌 切去约1.0cm枪尖(出口直径约3mm) 的1ml（蓝色）宽口吸嘴，高压灭菌 1.5ml eppendorf管（1.5ml离心管） 1ml吸嘴加热熔化制成匀浆棒 注意：所有吸打混匀操作均应尽量轻柔，慢慢吸取再慢慢打出，除非最后一次打出，否则吸嘴内留少量液体以免产生气泡。 方法 裂解： 单层（粘附）培养细胞的裂解 吸去培养液，加入5ml冰冷的PBS洗2次。加入1ml冰冷的PBS，用橡胶刮棒刮下细胞，将细胞悬液转移到冰上的1.5ml离心管中。用0.5ml冰冷的PBS洗培养皿，并入离心管中的细胞悬液； 4℃ 水平转子400g 离心5min或4℃ 角转子600g 离心10min，去上清收集细胞； 将细胞重悬于1ml 冰冷的PBS中，4℃ 水平转子400g 离心5min或4℃ 角转子600g 离心10min, 收集细胞； 将5×106 细胞重悬于20μl TE（PH8.0），反复轻柔吸打至无细胞凝块, 必要时可用匀浆棒匀浆； 加0.55ml 裂解液； 进行步骤2。 悬浮培养细胞的裂解 a．将细胞转移至10～15ml离心管，4℃ 水平转子400g 离心5min 或4℃ 角转子600g 离心10min，去上清，收集细胞； b．重悬5×106细胞于1ml冰冷的PBS并转移至1.5ml离心管，4℃ 水平转子400g 离心5min 或4℃ 角转子600g 离心10min， 去上清， 收集细胞。重复该步骤一次； c．将细胞重悬于20μl TE（PH 8.0），反复轻柔吸打至无细胞凝块，必要时可用匀浆棒匀浆； d．加入0.55ml 裂解液； e．进行步骤2。 新鲜血液细胞的裂解 a．加入2倍体积的1×PBS至抗凝的新鲜血液，吸打混匀，移至50ml离心管，4℃ 水平转子400g 离心5min 或4℃ 角转子600g 离心10min，去上清，留少量液体，重悬细胞； b．加9ml预冷的超纯ddH2O，振荡30－40s（votex 6-7），裂解红细胞。 c．加入3ml 3.4%PBS振荡混匀，使细胞溶液恢复等渗。 （第b，c步ddH2O与3.4%PBS加入的比例为3:1，可适量改变试剂用量，但一定要保证两者的比例为3:1。） d．4℃ 水平转子400g