琼脂糖凝胶电泳 西安医学院基础医学试验教学中心.pptVIP

西安医学院生化教研室 一 实验目的 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 鉴定质粒PUC19酶切结果 检测PCR的结果 一、决定DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素 DNA分子的大小 双链DNA分子在凝胶基质迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移得越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。 琼脂糖浓度 给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在DNA电泳迁移率的对数和凝胶浓度之间存在线状相关。 二 实验原理 二、琼脂糖凝胶电泳： 1．DNA分子大小：线性DNA分子在一定琼脂糖浓度内的迁移率与DNA分子量的对数成反比。 2．琼脂糖浓度：小于0.5kb 的DNA片段所需的凝胶浓度为1.2-1.5%; 分离大于10kb 的DNA片段所需的凝胶浓度为0.3-0.7%; DNA片段大小在两者之间的所需的凝胶浓度为0.8-1.0%。 分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度 琼脂糖（%） 分离DNA片段的有效范围（kb) 0.5 1-30 0.7 0.8-12 1.0 0.5-10 1.2 0.4-7 1.5 0.2-3 实验材料 水平电泳槽及制胶模具 琼脂糖 电泳缓冲液 6×凝胶载样缓冲液 DNA样品 DNA Marker DNA染料 溴化乙锭 / Gold view 紫外透射仪 琼脂糖 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃ 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 电泳缓冲液 凝胶上样缓冲液 （loading buffer） 在0.5X TBE 缓冲液中，溴酚兰相当于 300bpDNA, 二甲苯氰FF相当于 4000bp DNA。 DNA Marker 溴化乙锭 染料：溴化乙啶（EB），它可嵌入堆积的碱基对之间，在紫外灯下发荧光，检测DNA的下限可达1-10ng。注意：EB是强诱变剂！ 四 实验步骤 1、稀释缓冲液的制备：用蒸馏水将5?TBE缓冲液配制成0.5?TBE稀释缓冲液. 2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml 三角烧瓶中，进入50ml的0.5?TBE稀释缓冲液，放入微波炉或电炉加热至琼脂糖全部熔化，取出混匀。在冷却至50~600C的琼脂糖胶液中加入EB溶液至终浓度为0.5?g/ml, 混匀。小心地倒入电泳槽中至一定高度。待胶液完全凝固后拔出梳子。然后向槽内加0.5?TBE稀释缓冲液至液面刚好没过胶板表面。 3、上样：在DNA样品混匀6?上样缓冲液，小心加到凝胶 空中。同时加DNA Marker作为对照。 4、电泳：从负极到正极，80-100V电泳40min。 5、观察：在波长为254nm的紫外透射分析仪下观察DNA电泳带并估计其分子量大小。 M 1 2 3 4 PCR产物的 琼脂糖凝胶电泳 M 1 2 M M ： λ - EcoT 14 I Marker 1 ： 6,012 bp PCR 产物 2 ： 500 bp PCR 产物 7743bp 6623bp 925bp M 1 2 M M ： λ - EcoT 14 I Marker 1 ： 6,012 bp PCR 产物 2 ： 500 bp PCR 产物 7743bp 6623bp 925bp M: λ-EcoT14ⅠMarker