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结直肠癌异时性肝转移的分子标志物：miR-181a及其生物学功能 顾晋 陈治国 北京肿瘤医院 北京大学临床肿瘤学院 研究背景 microRNA的概念及其作用机制 研究背景 miRNA对肿瘤的发生发展起着重要的作用 miRNA在不同肿瘤组织中具有特征性表达模式 miRNA与肿瘤的生物学行为密切相关 可用于诊断CLL、乳腺癌和软组织肉瘤等肿瘤 miRNA与结直肠癌（CRC）肝转移的关系？ 实验目的 筛选可能有助于预测CRC肝转移的miRNAs CRC肝转移相关的miRNAs功能研究 实验方案 实验结果 完成miRNA芯片检测 无肝转移的CRC组织：5例 伴有同时性肝转移的CRC组织：5例 筛选出7个在两组间差异表达倍数大于1.7倍的miRNAs miR-181a，152，320a Let-7d，miR-15b，20b，223 实验结果 构建组织芯片 同时性肝转移的CRC原发灶 ：n=160 异时性肝转移的CRC原发灶 ：n=37 无肝转移的CRC原发灶：n=97 远癌正常CRC粘膜：n=72 原位杂交 Dig标记的LNA探针 实验结果 构建慢病毒过表达载体 LV-miR-181a-GFP LV-NC-GFP 慢病毒载体转染HT29细胞系 实验结果 表1. miRNAs在CRC组织中的表达情况 Figure 3.The expression of reporter gene GFP in HT29 cell line Figure 5. miR-181a enhance the proliferation of HT29 cell 结论 miR-181a对预测CRC异时性肝转移可能具有重要的意义 miR-181a高表达是预后不良的分子标志物 miR-181a促进HT29细胞的生长，迁移和浸润 对miR-181a功能的后续研究可能有助于阐明CRC异时性肝转移的调控机理 * 无肝转移的CRC 肝转移 miRNA表达的芯片检测 伴有同时性肝转移的CRC 生物信息学分析 原位杂交检测 筛选出CRC肝转移相关miRNAs 分子生物学验证 组织芯片构建 实验方案 体外培养 病毒感染 基因增强表达效率测定 比较转染前后生物学性状的改变 低转移潜能CRC细胞系HT29 接种 裸鼠移殖瘤 裸鼠局部成瘤能力 浸润能力 生长增殖 裸鼠局部瘤的转移潜能 携带miRNA前体的慢病毒表达载体 Figure 1. miRNA detection in colorectal cancer tissues by LNA-ISH. Figure 2. . overall survival in CRC patients with different expression level of miR-181a Figure 4.The fold change of the miR-181a expression in cell line Figure 6. miR-181a enhance the migration of HT29 cell in vitro Figure 7. miR-181a enhance the migration and invasion of HT29 cell in vitro Figure 8. In vivo tumor growth in NOD-SCID mice Figure 9. Xenograft tumors in three groups microRNAs （ miRNAs ）是一种长约21－25核苷酸长度的单链小分子RNA (其类似于 小干扰RNA:siRNA分子)，它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA, ，编码miRNA的基因转录后生成miRNA前体，然后在Dicer酶以及Drosha酶的作用下被剪切为成熟miRNA, 成熟的miRNA可通过核酸序列的互补性结合到特定的靶 mRNA的3’ 非翻译区上,如果序列完全匹配就可发挥引导靶mRNA降解的作用(该过程类似于小干扰RNA的作用过程),如果不是完全匹配则发挥抑制靶mRNA的表达的作用,所以一个miRNA可以调控多个靶基因的表达,同时多个miRNA也可共同作用于同一个靶基因,从而形成一个复杂的调控网络。 主要功能：调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达 越来越多的研究表明miRNA对肿瘤的发生发展起着重要的作用, George等的研究发现位于染色体13q14的miRNA在慢性B淋巴细胞白血病患者中发生缺失或表达下调的比率很高 miR-143 和 miR-145